Гранулы, модифицированные порфирином, для использования в качестве компенсационного контроля в проточной цитометрии
Summary
В протоколе описывается, как компенсационные шарики на основе порфирина для проточной цитометрии получают реакцией аминофункционализированных полистирольных шариков с порфирином TCPP и амидным связывающим реагентом EDC. Процедура фильтрации используется для уменьшения количества побочных продуктов твердых частиц.
Abstract
Проточная цитометрия может быстро охарактеризовать и количественно оценить различные клеточные популяции на основе измерений флуоресценции. Клетки сначала окрашивают одним или несколькими флуоресцентными реагентами, каждый из которых функционализируется другой флуоресцентной молекулой (флуорофором), которая избирательно связывается с клетками на основе их фенотипических характеристик, таких как экспрессия антигена на поверхности клетки. Интенсивность флуоресценции от каждого реагента, связанного с клетками, может быть измерена на проточном цитометре с использованием каналов, которые обнаруживают заданный диапазон длин волн. При использовании нескольких флуорофоров свет от отдельных флуорофоров часто перетекает в нежелательные каналы обнаружения, что требует коррекции данных об интенсивности флуоресценции в процессе, называемом компенсацией.
Компенсационные контрольные частицы, обычно полимерные шарики, связанные с одним флуорофором, необходимы для каждого флуорофора, используемого в эксперименте по маркировке клеток. Данные компенсационных частиц из проточного цитометра используются для внесения поправок в измерения интенсивности флуоресценции. В этом протоколе описывается приготовление и очистка полистирольных компенсационных шариков, ковалентно функционализированных флуоресцентным реагентом мезотетра(4-карбоксифенил)порфин (TCPP), и их применение для компенсации проточной цитометрии. В этой работе аминофункционализированные полистирольные шарики обрабатывали TCPP и амидным связывающим реагентом EDC (N-(3-диметиламинопропил)-N’-этилкарбодиимид гидрохлорид) при рН 6 и при комнатной температуре в течение 16 ч с перемешиванием. Гранулы TCPP выделяли центрифугированием и ресуспендировали в буфере pH 7 для хранения. В качестве побочного продукта наблюдались частицы, связанные с TCPP. Количество этих частиц может быть уменьшено с помощью дополнительного протокола фильтрации. Полученные гранулы TCPP были успешно использованы на проточном цитометре для компенсации в экспериментах с клетками мокроты человека, меченными несколькими флуорофорами. Бусины TCPP оказались стабильными после хранения в холодильнике в течение 300 дней.
Introduction
Порфирины уже много лет представляют интерес в области биомедицины из-за их флуоресцентных и опухолевых свойств 1,2,3. Терапевтические применения, такие как фотодинамическая терапия (ФДТ) и сонодинамическая терапия (СДТ), влекут за собой системное введение порфирина больному раком, накопление препарата в опухоли и локализованное воздействие на опухоль лазерным светом определенной длины волны или ультразвуком. Воздействие лазерного излучения или ультразвука приводит к образованию порфирином активных форм кислорода и последующей гибели клеток 4,5. В фотодинамической диагностике (PDD) флуоресценция порфирина используется для отличия раковых клеток от нормальныхклеток 6. В этом контексте протопорфирин IX, природный флуоресцентный порфирин, который накапливается в опухолях при системной или местной инъекции своего предшественника, 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК), используется для выявления стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта, рака мочевого пузыря и рака головного мозга 7,8. Совсем недавно лечение 5-АЛК было изучено как подход к выявлению минимального остаточного заболевания при множественной миеломе9. Наша лаборатория использует тетраарилпорфирин TCPP (5,10,15,20-тетракис-(4-карбоксифенил)-21,23H-порфин) из-за его способности селективно окрашивать клетки рака легких и связанные с раком клетки в образцах мокроты человека, что является свойством, которое было использовано в диагностических анализах на основе слайдов и проточных цитометрических диагностических анализах10.
Некоторые порфирины являются бифункциональными в том смысле, что их можно использовать в качестве терапевтических и диагностических средств 2,11. В биомедицинских исследованиях такие бифункциональные порфирины используются для оценки того, как их способность избирательно нацеливаться и убивать раковые клетки зависит от их структуры, а также как на нее влияет присутствие других соединений 12,13,14,15,16. Как клеточное поглощение порфиринов, так и их цитотоксичность могут быть измерены на проточной цитометрической платформе с высокой пропускной способностью. Спектры поглощения и излучения флуоресцентных порфиринов сложны, но большинство проточных цитометрических платформ оборудованы для их правильной идентификации. Спектр поглощения флуоресцентных порфиринов характеризуется сильной полосой поглощения в диапазоне 380-500 нм, известной как полоса Соре. В диапазоне 500–750 нм (Q-полосы) обычно наблюдаются от двух до четырех более слабых полос поглощения17. Синий лазер с длиной волны 488 нм, присутствующий в большинстве проточных цитометров, или фиолетовый лазер (405 нм) могут генерировать свет соответствующей длины волны для возбуждения порфиринов. Спектры излучения порфиринов обычно показывают пики в диапазоне 600-800 нм18, что приводит к очень небольшому спектральному перекрытию с флуоресцеин-изотиоцианатом или фикоэритриновыми (ПЭ) флуорофорами, но к значительному перекрытию с другими часто используемыми флуорофорами, такими как аллофикоцианин (APC), а также тандемные флуорофоры, такие как PE-Cy5 и другие. Следовательно, при использовании порфиринов в многоцветных анализах проточной цитометрии контроль одиночных флуорофоров необходим для адекватной коррекции распространения флуоресценции в каналах, отличных от того, который предназначен для измерения флуоресценции порфирина.
В идеале однофлуорофорные контрольные элементы, используемые для расчета матрицы побочных эффектов для панели флуорофоров (также называемые «компенсационными контролями»), должны состоять из того же типа (ов) клеток, что и образец. Однако использование выборки для этой цели не является оптимальным, если для начала очень мало выборки или если целевая популяция в выборке очень мала (например, если кто-то хочет посмотреть на минимальное остаточное заболевание или раковые клетки на ранних стадиях заболевания). Полезной альтернативой клеткам являются шарики в сочетании с тем же флуорофором, который используется для анализа образца. Многие такие бусины имеются в продаже; Эти шарики либо предварительно мечены желаемым флуорофором (предварительно меченные флуорофор-специфические шарики)19,20, либо к ним может быть прикреплено флуоресцентно меченное антитело (шарики захвата антител)20,21. В то время как коммерческие компенсационные шарики доступны для многих флуорофоров, такие шарики недоступны для порфиринов, несмотря на их растущее использование в фундаментальных и клинических исследованиях.
В дополнение к сохранению образцов и соответствующему размеру положительных и отрицательных популяций, другими преимуществами использования шариков в качестве компенсационных контролеров являются простота приготовления, низкая фоновая флуоресценция и превосходная стабильность во времени22. Потенциальным недостатком использования шариков в качестве компенсационного контроля является то, что спектр излучения флуоресцентного антитела, захваченного на шариках, может отличаться от спектра того же антитела, используемого для маркировки клеток. Это может иметь особое значение при использовании спектрального проточного цитометра20. Следовательно, разработка шариков в качестве компенсационного контроля должна быть выполнена на проточном цитометре, который будет использоваться для анализа, для которого разрабатываются шарики. Кроме того, разработка шариков должна включать сравнение с клетками, меченными тем же флуоресцентным окрашивающим реагентом.
Здесь мы описываем приготовление полистирольных компенсационных шариков, функционализированных амином TCPP, средняя интенсивность флуоресценции которых в канале детектирования была сопоставима с таковой у меченных TCPP клеток в мокроте, и их использование в качестве компенсационного контроля для проточной цитометрии. Автофлуоресценция эквивалентных нефункционализированных шариков была достаточно низкой для их использования в качестве контроля компенсации отрицательной флуоресценции. Кроме того, эти бусины продемонстрировали стабильность при хранении в течение почти 1 года.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на многочисленные применения порфиринов в диагностике и терапии рака2, существует ограниченная литература об их потенциальном использовании в качестве проточного цитометрического реагента для идентификации раковых и нераковых клеточных популяций в первичных ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Родригеса за помощь в подготовке фигуры и Precision Pathology Services (Сан-Антонио, Техас) за использование проточного цитометра Navios EX.
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
Riferimenti
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
- Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
- Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
- Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
- Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
- Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
- Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis – The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
- Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
- Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
- Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
- Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
- Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
- Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
- Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
- Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
- Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
- Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
- Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
- Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
- Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
- Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
- . US6838248B2 – Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
- . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
- Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
- Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
- Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chimica. 15 (17), 2588-2621 (2020).
- . US7670799B2 – Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
- Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
- Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
- Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochimica. 57 (2), 173-174 (2018).
- El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).
