Perlas modificadas con porfirina para uso como controles de compensación en citometría de flujo
Summary
El protocolo describe cómo se preparan las perlas de compensación basadas en porfirina para la citometría de flujo mediante la reacción de perlas de poliestireno funcionalizadas con amina con la porfirina TCPP y el reactivo de acoplamiento de amida EDC. Se utiliza un procedimiento de filtración para reducir los subproductos de partículas.
Abstract
La citometría de flujo puede caracterizar y cuantificar rápidamente diversas poblaciones celulares basadas en mediciones de fluorescencia. Las células se tiñen primero con uno o más reactivos fluorescentes, cada uno funcionalizado con una molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se une a las células selectivamente en función de sus características fenotípicas, como la expresión de antígenos de superficie celular. La intensidad de la fluorescencia de cada reactivo unido a las células se puede medir en el citómetro de flujo utilizando canales que detectan un rango específico de longitudes de onda. Cuando se utilizan múltiples fluoróforos, la luz de fluoróforos individuales a menudo se derrama en canales de detección no deseados, lo que requiere una corrección de los datos de intensidad de fluorescencia en un proceso llamado compensación.
Las partículas de control de compensación, típicamente perlas de polímero unidas a un solo fluoróforo, son necesarias para cada fluoróforo utilizado en un experimento de etiquetado celular. Los datos de las partículas de compensación del citómetro de flujo se utilizan para aplicar una corrección a las mediciones de intensidad de fluorescencia. Este protocolo describe la preparación y purificación de perlas de compensación de poliestireno funcionalizadas covalentemente con el reactivo fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) y su aplicación en compensación por citometría de flujo. En este trabajo, las perlas de poliestireno funcionalizadas con aminas se trataron con TCPP y el reactivo de acoplamiento de amida EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) a pH 6 y a temperatura ambiente durante 16 h con agitación. Las perlas TCPP se aislaron por centrifugación y se resuspendieron en un tampón de pH 7 para su almacenamiento. Las partículas relacionadas con TCPP se observaron como un subproducto. El número de estas partículas podría reducirse utilizando un protocolo de filtración opcional. Las perlas TCPP resultantes se utilizaron con éxito en un citómetro de flujo para la compensación en experimentos con células de esputo humano marcadas con múltiples fluoróforos. Las perlas TCPP demostraron ser estables después del almacenamiento en un refrigerador durante 300 días.
Introduction
Las porfirinas han sido de interés durante muchos años en el campo biomédico debido a sus propiedades fluorescentes y dirigidas a tumores 1,2,3. Las aplicaciones terapéuticas como la terapia fotodinámica (TFD) y la terapia sonodinámica (SDT) implican la administración sistémica de una porfirina a un paciente con cáncer, la acumulación del fármaco en el tumor y la exposición localizada del tumor a una luz láser de una longitud de onda específica o ultrasonido. La exposición a la luz láser o ultrasonido conduce a la generación de especies reactivas de oxígeno por la porfirina y la posterior muerte celular 4,5. En el diagnóstico fotodinámico (PDD), la fluorescencia de porfirina se utiliza para distinguir las células cancerosas de las células normales6. En este contexto, la protoporfirina IX, una porfirina fluorescente natural que se acumula en los tumores tras la inyección sistémica o local de su precursor, el ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), se utiliza para identificar tumores del estroma gastrointestinal, cáncer de vejiga y cáncer cerebral 7,8. Más recientemente, se exploró el tratamiento con 5-ALA como un enfoque para detectar la enfermedad residual mínima en el mieloma múltiple9. Nuestro laboratorio ha estado utilizando la tetraarilo porfirina TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxifenil)-21,23H-porfina) por su capacidad para teñir selectivamente células de cáncer de pulmón y células asociadas al cáncer en muestras de esputo humano, que es una propiedad que ha sido explotada en ensayos diagnósticos basados en portaobjetos y citométricos de flujo10.
Algunas porfirinas son bifuncionales en el sentido de que pueden ser utilizadas como agentes terapéuticos y diagnósticos 2,11. En la investigación biomédica, tales porfirinas bifuncionales se utilizan para evaluar cómo su capacidad para atacar selectivamente y matar las células cancerosas es una función de su estructura, así como la forma en que se ve afectada por la presencia de otros compuestos 12,13,14,15,16. Tanto la absorción celular de porfirinas como su citotoxicidad se pueden medir en una plataforma citométrica de flujo de una manera de alto rendimiento. Los espectros de absorción y emisión de las porfirinas fluorescentes son complejos, pero la mayoría de las plataformas citométricas de flujo están equipadas para identificarlas correctamente. El espectro de absorción de las porfirinas fluorescentes se caracteriza por una fuerte banda de absorción en el rango de 380-500 nm, conocida como la banda de Soret. De dos a cuatro bandas de absorción más débiles se observan generalmente en el rango de 500-750 nm (bandas Q)17. Un láser azul de 488 nm, presente en la mayoría de los citómetros de flujo, o un láser violeta (405 nm) pueden generar luz de la longitud de onda apropiada para excitar las porfirinas. Los espectros de emisión de las porfirinas suelen mostrar picos en el rango de 600-800 nm18, lo que resulta en muy poca superposición espectral con fluoróforos de isotiocianato de fluoresceína o ficoeritrina (PE), pero una superposición considerable con otros fluoróforos de uso frecuente, como la aloficocianina (APC), así como fluoróforos en tándem, como PE-Cy5 y otros. Por lo tanto, cuando se usan porfirinas en ensayos de citometría de flujo multicolor, los controles de fluoróforo único son esenciales para corregir adecuadamente el derrame de fluorescencia en canales distintos del designado para medir la fluorescencia de la porfirina.
Idealmente, los controles de fluoróforo único utilizados para calcular la matriz de derrame para un panel de fluoróforos (también llamados “controles de compensación”) deberían consistir en el mismo tipo de célula que la muestra. Sin embargo, el uso de la muestra para este propósito no es óptimo si hay muy poca muestra para empezar o si la población objetivo dentro de la muestra es muy pequeña (por ejemplo, si se quiere observar la enfermedad residual mínima o las células cancerosas en las primeras etapas de la enfermedad). Una alternativa útil a las células son las perlas acopladas con el mismo fluoróforo que se utiliza para analizar la muestra. Muchas de estas cuentas están disponibles comercialmente; Estas perlas están premarcadas con el fluoróforo deseado (perlas específicas de fluoróforos preetiquetadas)19,20, o se les puede unir un anticuerpo marcado con fluorescencia (perlas de captura de anticuerpos)20,21. Si bien las perlas de compensación comerciales están disponibles para muchos fluoróforos, tales perlas no están disponibles para las porfirinas, a pesar de su creciente uso en la investigación básica y clínica.
Además de la preservación de la muestra y las poblaciones positivas versus negativas de tamaño adecuado, las otras ventajas de usar perlas como controles de compensación son la facilidad de preparación, la baja fluorescencia de fondo y la excelente estabilidad en el tiempo22. La desventaja potencial de usar perlas como control de compensación es que el espectro de emisión del anticuerpo fluorescente capturado en las perlas puede diferir del del mismo anticuerpo utilizado para etiquetar las células. Esto puede ser de importancia específica cuando se utiliza un citómetro de flujo espectral20. Por lo tanto, el desarrollo de perlas como control de compensación debe realizarse en el citómetro de flujo que se utilizará para el ensayo para el que se desarrollan las perlas. Además, el desarrollo de las perlas debe incluir una comparación con las células marcadas con el mismo reactivo de tinción fluorescente.
Aquí, describimos la preparación de perlas de compensación de poliestireno funcionalizadas con amina TCPP, cuya intensidad de fluorescencia mediana en el canal de detección fue comparable a la de las células marcadas con TCPP en esputo, y su uso como controles de compensación para la citometría de flujo. La autofluorescencia de perlas equivalentes no funcionalizadas fue lo suficientemente baja para su uso como controles de compensación de fluorescencia negativa. Además, estas perlas demostraron estabilidad en el almacenamiento durante casi 1 año.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de las muchas aplicaciones de las porfirinas en el diagnóstico y la terapéutica del cáncer2, existe una literatura limitada sobre su uso potencial como reactivo citométrico de flujo para la identificación de poblaciones celulares cancerosas versus no cancerosas en tejidos humanos primarios24,25,26. Nuestra investigación sobre el análisis citométrico de flujo del esputo humano<sup class="xr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a David Rodríguez por su ayuda con la preparación de figuras y Precision Pathology Services (San Antonio, TX) por el uso de su citómetro de flujo Navios EX.
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
Riferimenti
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