Porfyrinmodifierade pärlor för användning som kompensationskontroller i flödescytometri
Summary
Protokollet beskriver hur porfyrinbaserade kompensationspärlor för flödescytometri framställs genom reaktion av aminfunktionaliserade polystyrenpärlor med porfyrin TCPP och amidkopplingsreagenset EDC. Ett filtreringsförfarande används för att minska partikelbiprodukterna.
Abstract
Flödescytometri kan snabbt karakterisera och kvantifiera olika cellpopulationer baserat på fluorescensmätningar. Cellerna färgas först med ett eller flera fluorescerande reagens, var och en funktionaliserad med en annan fluorescerande molekyl (fluorofor) som binder till celler selektivt baserat på deras fenotypiska egenskaper, såsom cellytans antigenuttryck. Intensiteten av fluorescens från varje reagens bundet till celler kan mätas på flödescytometern med hjälp av kanaler som detekterar ett specificerat våglängdsområde. När flera fluoroforer används spiller ljuset från enskilda fluoroforer ofta över till oönskade detektionskanaler, vilket kräver en korrigering av fluorescensintensitetsdata i en process som kallas kompensation.
Kompensationskontrollpartiklar, vanligtvis polymerpärlor bundna till en enda fluorofor, behövs för varje fluorofor som används i ett cellmärkningsexperiment. Data från kompensationspartiklar från flödescytometern används för att tillämpa en korrigering på fluorescensintensitetsmätningarna. Detta protokoll beskriver beredning och rening av polystyrenkompensationspärlor kovalent funktionaliserade med det fluorescerande reagenset mesotetra (4-karboxifenyl) porfin (TCPP) och deras tillämpning i flödescytometrikompensation. I detta arbete behandlades aminfunktionaliserade polystyrenpärlor med TCPP och amidkopplingsreagenset EDC (N-(3-dimetylaminopropyl)-N′-etylkarbodiimidhydroklorid) vid pH 6 och vid rumstemperatur i 16 timmar med omrörning. TCPP-pärlorna isolerades genom centrifugering och återsuspenderades i en pH 7-buffert för lagring. TCPP-relaterade partiklar observerades som en biprodukt. Antalet av dessa partiklar kan minskas med hjälp av ett valfritt filtreringsprotokoll. De resulterande TCPP-pärlorna användes framgångsrikt på en flödescytometer för kompensation i experiment med humana sputumceller märkta med flera fluoroforer. TCPP-pärlorna visade sig vara stabila efter förvaring i kylskåp i 300 dagar.
Introduction
Porfyriner har varit av intresse i många år inom det biomedicinska området på grund av deras fluorescens och tumörriktade egenskaper 1,2,3. Terapeutiska tillämpningar såsom fotodynamisk terapi (PDT) och sonodynamisk terapi (SDT) innefattar systemisk administrering av ett porfyrin till en cancerpatient, ackumulering av läkemedlet i tumören och lokaliserad exponering av tumören för ett laserljus med en specifik våglängd eller ultraljud. Exponeringen för laserljus eller ultraljud leder till generering av reaktiva syreradikaler av porfyrinet och efterföljande celldöd 4,5. Vid fotodynamisk diagnos (PDD) används porfyrinfluorescens för att skilja cancerceller från normala celler6. I detta sammanhang används protoporfyrin IX, ett naturligt fluorescerande porfyrin som ackumuleras i tumörer vid systemisk eller lokal injektion av dess föregångare, 5-aminolevulinsyra (5-ALA), för att identifiera gastrointestinala stromatumörer, blåscancer och hjärncancer 7,8. På senare tid undersöktes 5-ALA-behandling som ett tillvägagångssätt för att upptäcka minimal kvarvarande sjukdom i multipelt myelom9. Vårt laboratorium har använt tetraarylporfyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-karboxifenyl)-21,23 H-porfin) för sin förmåga att selektivt färga lungcancerceller och cancerassocierade celler i humana sputumprover, vilket är en egenskap som har utnyttjats i objektglasbaserade och flödescytometriska diagnostiska analyser10.
Vissa porfyriner är bifunktionella genom att de kan användas som terapeutiska och diagnostiska medel 2,11. I biomedicinsk forskning används sådana bifunktionella porfyriner för att utvärdera hur deras förmåga att selektivt rikta in sig på och döda cancerceller är en funktion av deras struktur samt hur den påverkas av närvaron av andra föreningar 12,13,14,15,16. Både det cellulära upptaget av porfyriner och deras cytotoxicitet kan mätas på en flödescytometrisk plattform på ett sätt med hög genomströmning. Absorptions- och emissionsspektra för fluorescerande porfyriner är komplexa, men de flesta flödescytometriska plattformar är utrustade för att korrekt identifiera dem. Absorptionsspektrumet för fluorescerande porfyriner kännetecknas av ett starkt absorptionsband i intervallet 380-500 nm, känt som Soret-bandet. Två till fyra svagare absorptionsband observeras i allmänhet i intervallet 500–750 nm (Q-band)17. En blå 488 nm laser, närvarande i de flesta flödescytometrar, eller en violett laser (405 nm) kan generera ljus med lämplig våglängd för att excitera porfyriner. Emissionsspektra för porfyriner visar typiskt toppar i 600-800 nm-området18, vilket resulterar i mycket liten spektral överlappning med fluoresceinisotiocyanat eller fykoerytrin (PE) fluoroforer men betydande överlappning med andra ofta använda fluoroforer, såsom allophycocyanin (APC), liksom tandemfluoroforer, såsom PE-Cy5 och andra. Vid användning av porfyriner i flerfärgsflödescytometrianalyser är därför enkelfluoroforkontroller väsentliga för att på ett adekvat sätt korrigera spridningen av fluorescens i andra kanaler än den som är avsedd att mäta porfyrinets fluorescens.
Helst bör de enkelfluoroforkontroller som används för att beräkna spridningsmatrisen för en panel av fluoroforer (även kallade kompensationskontroller) bestå av samma celltyp(er) som provet. Att använda provet för detta ändamål är dock inte optimalt om det finns mycket lite prov till att börja med eller om målpopulationen inom provet är mycket liten (till exempel om man vill titta på minimal kvarvarande sjukdom eller cancerceller i de tidiga stadierna av sjukdomen). Ett användbart alternativ till celler är pärlor i kombination med samma fluorofor som används för att analysera provet. Många sådana pärlor är kommersiellt tillgängliga; Dessa pärlor är antingen förmärkta med önskad fluorofor (förmärkta fluoroforspecifika pärlor)19,20, eller en fluorescerande märkt antikropp kan fästas på dem (antikroppsfångande pärlor)20,21. Medan kommersiella kompensationspärlor är tillgängliga för många fluoroforer, är sådana pärlor inte tillgängliga för porfyriner, trots deras ökande användning i grundforskning och klinisk forskning.
Förutom provbevarande och positivt kontra negativa populationer av lämplig storlek är de andra fördelarna med att använda pärlor som kompensationskontroller enkel förberedelse, låg bakgrundsfluorescens och utmärkt stabilitet över tid22. Den potentiella nackdelen med att använda pärlor som kompensationskontroll är att emissionsspektrumet för den fluorescerande antikroppen som fångas på pärlor kan skilja sig från samma antikropp som används för att märka cellerna. Detta kan vara av särskild betydelse vid användning av en spektralflödescytometer20. Därför måste utvecklingen av pärlor som kompensationskontroll utföras på flödescytometern som kommer att användas för analysen för vilken pärlorna utvecklas. Dessutom måste utvecklingen av pärlorna inkludera en jämförelse med celler märkta med samma fluorescerande färgningsreagens.
Här beskriver vi beredningen av TCPP-aminfunktionaliserade polystyrenkompensationspärlor, vars medianfluorescensintensitet i detektionskanalen var jämförbar med den för TCPP-märkta celler i sputum, och deras användning som kompensationskontroller för flödescytometri. Autofluorescensen hos ekvivalenta, icke-funktionaliserade kulor var tillräckligt låg för att de skulle kunna användas som negativa fluorescenskompensationskontroller. Dessutom visade dessa pärlor stabilitet i lagring i nästan 1 år.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots de många tillämpningarna av porfyriner vid cancerdiagnostik och terapi2 finns det begränsad litteratur om deras potentiella användning som flödescytometriskt reagens för identifiering av cancerogena kontra icke-cancerösa cellpopulationer i primära mänskliga vävnader24,25,26. Vår forskning om flödescytometrisk analys av humant sputum24,27<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka David Rodriguez för hjälp med figurberedning och Precision Pathology Services (San Antonio, TX) för användningen av dess Navios EX-flödescytometer.
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
Riferimenti
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
- Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
- Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
- Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
- Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
- Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
- Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis – The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
- Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
- Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
- Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
- Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
- Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
- Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
- Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
- Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
- Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
- Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
- Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
- Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
- Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
- Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
- . US6838248B2 – Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
- . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
- Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
- Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
- Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chimica. 15 (17), 2588-2621 (2020).
- . US7670799B2 – Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
- Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
- Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
- Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochimica. 57 (2), 173-174 (2018).
- El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).
