Pérolas Modificadas com Porfirina para Uso como Controle de Compensação em Citometria de Fluxo

Summary

O protocolo descreve como esferas de compensação à base de porfirina para citometria de fluxo são preparadas pela reação de esferas de poliestireno funcionalizadas com amina com a porfirina TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC. Um procedimento de filtração é usado para reduzir os subprodutos particulados.

Abstract

A citometria de fluxo pode caracterizar e quantificar rapidamente diversas populações celulares com base em medidas de fluorescência. As células são primeiramente coradas com um ou mais reagentes fluorescentes, cada um funcionalizado com uma molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se liga às células seletivamente com base em suas características fenotípicas, como a expressão de antígenos de superfície celular. A intensidade de fluorescência de cada reagente ligado às células pode ser medida no citômetro de fluxo usando canais que detectam uma faixa especificada de comprimentos de onda. Quando múltiplos fluoróforos são usados, a luz de fluoróforos individuais geralmente transborda para canais de detecção indesejados, o que requer uma correção nos dados de intensidade de fluorescência em um processo chamado compensação.

Partículas de controle de compensação, tipicamente esferas de polímero ligadas a um único fluoróforo, são necessárias para cada fluoróforo usado em um experimento de marcação celular. Os dados das partículas de compensação do citômetro de fluxo são usados para aplicar uma correção nas medidas de intensidade de fluorescência. Este protocolo descreve a preparação e purificação de esferas de compensação de poliestireno funcionalizadas covalentemente com o reagente fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) e sua aplicação na compensação por citometria de fluxo. Neste trabalho, esferas de poliestireno funcionalizadas com amina foram tratadas com TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC (cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) em pH 6 e à temperatura ambiente por 16 h com agitação. As esferas de TCPP foram isoladas por centrifugação e ressuspensas em tampão pH 7 para armazenamento. Partículas relacionadas ao TCPP foram observadas como subproduto. O número dessas partículas poderia ser reduzido usando um protocolo de filtração opcional. As esferas TCPP resultantes foram usadas com sucesso em um citômetro de fluxo para compensação em experimentos com células de escarro humano marcadas com múltiplos fluoróforos. As esferas de TCPP mostraram-se estáveis após armazenamento em geladeira por 300 dias.

Introduction

As porfirinas têm sido de interesse há muitos anos na área biomédica devido às suas propriedades fluorescentes e de direcionamento tumoral ^1,2,3. Aplicações terapêuticas como a terapia fotodinâmica (TFD) e a terapia sonodinâmica (TSD) envolvem a administração sistêmica de uma porfirina a um paciente com câncer, o acúmulo da droga no tumor e a exposição localizada do tumor a uma luz laser de um comprimento de onda específico ou ultrassom. A exposição à luz laser ou ao ultrassom leva à geração de espécies reativas de oxigênio pela porfirina e subsequente morte celular ^4,5. No diagnóstico fotodinâmico (TID), a fluorescência da porfirina é usada para distinguir células cancerosas de células normais⁶. Nesse contexto, a protoporfirina IX, uma porfirina fluorescente natural que se acumula nos tumores após a injeção sistêmica ou local de seu precursor, o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), é utilizada para identificar tumores estromais gastrointestinais, câncer de bexiga e câncer^cerebral7,8. Mais recentemente, o tratamento com 5-ALA foi explorado como uma abordagem para detectar doença residual mínima no mieloma^múltiplo9. Nosso laboratório vem utilizando a tetraarila porfirina TCPP (5,10,15,20-tetraquis-(4-carboxifenil)-21,23H-porfina) por sua capacidade de corar seletivamente células de câncer de pulmão e células associadas ao câncer em amostras de escarro humano, propriedade que tem sido explorada em ensaios diagnósticos baseados em lâminas e citometria de fluxo¹⁰.

Algumas porfirinas são bifuncionais, podendo ser utilizadas como agentes terapêuticos e^{diagnósticos 2,11}. Em pesquisas biomédicas, tais porfirinas bifuncionais são utilizadas para avaliar como sua capacidade de atingir e matar seletivamente células cancerosas é função de sua estrutura, bem como é afetada pela presença de outros compostos 12,13,14,15,16. Tanto a captação celular de porfirinas quanto sua citotoxicidade podem ser medidas em uma plataforma de citometria de fluxo de maneira de alto rendimento. Os espectros de absorção e emissão de porfirinas fluorescentes são complexos, mas a maioria das plataformas de citometria de fluxo está equipada para identificá-los corretamente. O espectro de absorção das porfirinas fluorescentes é caracterizado por uma forte banda de absorção na faixa de 380-500 nm, conhecida como banda de Soret. Duas a quatro bandas de absorção mais fracas são geralmente observadas na faixa de 500-750 nm (bandas Q)¹⁷. Um laser azul de 488 nm, presente na maioria dos citômetros de fluxo, ou um laser violeta (405 nm) podem gerar luz do comprimento de onda apropriado para excitar porfirinas. Os espectros de emissão das porfirinas tipicamente exibem picos na faixa de 600-800 nm¹⁸, o que resulta em muito pouca sobreposição espectral com fluoróforos de isotiocianato de fluoresceína ou ficoeritrina (PE), mas considerável sobreposição com outros fluoróforos frequentemente usados, como aloficocianina (APC), bem como fluoróforos tandem, como PE-Cy5 e outros. Portanto, ao usar porfirinas em ensaios de citometria de fluxo multicolorida, controles de fluoróforo único são essenciais para corrigir adequadamente o transbordamento da fluorescência em canais diferentes daquele designado para medir a fluorescência da porfirina.

Idealmente, os controles de fluoróforo único usados para calcular a matriz de transbordamento para um painel de fluoróforos (também chamados de “controles de compensação”) devem consistir no(s) mesmo(s) tipo(s) de célula que a amostra. No entanto, usar a amostra para esse propósito não é ideal se houver muito pouca amostra para começar ou se a população-alvo dentro da amostra for muito pequena (por exemplo, se quisermos olhar para doença residual mínima ou células cancerosas nos estágios iniciais da doença). Uma alternativa útil às células são as esferas acopladas ao mesmo fluoróforo que é usado para analisar a amostra. Muitas dessas contas estão disponíveis comercialmente; Essas esferas são pré-marcadas com o fluoróforo desejado (esferas específicas de fluoróforo pré-marcadas)^19,20, ou um anticorpo fluorescentemente marcado pode ser anexado a elas (esferas de captura de anticorpos)^20,21. Enquanto esferas de compensação comercial estão disponíveis para muitos fluoróforos, tais contas não estão disponíveis para porfirinas, apesar de seu uso crescente em pesquisa básica e clínica.

Além da preservação da amostra e do dimensionamento adequado das populações positivas versus negativas, as outras vantagens do uso de esferas como controles de compensação são a facilidade de preparo, a baixa fluorescência de fundo e a excelente estabilidade ao longo do tempo²². A desvantagem potencial do uso de contas como um controle de compensação é que o espectro de emissão do anticorpo fluorescente capturado em esferas pode diferir daquele do mesmo anticorpo usado para marcar as células. Isso pode ser de importância específica quando se utiliza um citômetro de fluxo espectral²⁰. Portanto, o desenvolvimento de contas como controle de compensação precisa ser realizado no citômetro de fluxo que será utilizado para o ensaio para o qual as contas são desenvolvidas. Além disso, o desenvolvimento das esferas precisa incluir uma comparação com células marcadas com o mesmo reagente de coloração fluorescente.

Aqui, descrevemos a preparação de esferas de compensação de poliestireno funcionalizadas com amina TCPP, cuja intensidade mediana de fluorescência no canal de detecção foi comparável à das células marcadas com TCPP no escarro, e seu uso como controles de compensação para citometria de fluxo. A autofluorescência de esferas equivalentes não funcionalizadas foi suficientemente baixa para seu uso como controles de compensação de fluorescência negativa. Além disso, essas contas demonstraram estabilidade no armazenamento por quase 1 ano.

Protocol

Todos os procedimentos precisam ser feitos com equipamentos de proteção individual adequados. 1. Preparo da solução-estoque de TCPP, 1,0 mg/mL NOTA: Isso pode ser preparado mensalmente. Usando uma balança analítica, espátula e papel de pesagem, pesar 49,0-50,9 mg de TCPP. Arredondar o peso para 1/10 de miligrama. Separe a quantidade medida de TCPP protegida da luz.Observação : use uma arma estática se a leitura de peso é ins…

Representative Results

Este protocolo para a marcação TCPP de contas é relativamente rápido e eficiente. A Figura 1 mostra um resultado representativo do processo de marcação de esferas TCPP determinado por citometria de fluxo. A Figura 1A mostra o perfil padronizado das contas Rainbow, conforme detectado no canal apropriado para detecção de TCPP. Essas esferas servem como um QC para a padronização das tensões do laser para a detecção de TCPP pelo citômetro de fluxo. <st…

Discussion

Apesar das inúmeras aplicações das porfirinas no diagnóstico e terapêutica do^câncer2, há pouca literatura sobre seu potencial uso como reagente de citometria de fluxo para a identificação de populações de células cancerosas versus não cancerosas em tecidos humanos primários24,25,26. Nossa pesquisa na análise por citometria de fluxo do escarro humano^24,27<s…

Materials

Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable – 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable – 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365