Il protocollo descrive come le sfere di compensazione a base di porfirina per la citometria a flusso vengono preparate dalla reazione di perle di polistirene funzionalizzato con la porfirina TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC. Una procedura di filtrazione viene utilizzata per ridurre i sottoprodotti del particolato.
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Articolo metodologico
Perle modificate con porfirina da utilizzare come controllo di compensazione nella citometria a flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
La citometria a flusso può rapidamente caratterizzare e quantificare diverse popolazioni cellulari sulla base di misurazioni di fluorescenza. Le cellule vengono prima colorate con uno o più reagenti fluorescenti, ciascuno funzionalizzato con una diversa molecola fluorescente (fluoroforo) che si lega alle cellule selettivamente in base alle loro caratteristiche fenotipiche, come l'espressione dell'antigene della superficie cellulare. L'intensità della fluorescenza da ciascun reagente legato alle cellule può essere misurata sul citometro a flusso utilizzando canali che rilevano una gamma specifica di lunghezze d'onda. Quando vengono utilizzati più fluorofori, la luce dei singoli fluorofori spesso si riversa in canali di rilevamento indesiderati, il che richiede una correzione dei dati di intensità della fluorescenza in un processo chiamato compensazione.
Le particelle di controllo della compensazione, tipicamente perle polimeriche legate a un singolo fluoroforo, sono necessarie per ogni fluoroforo utilizzato in un esperimento di etichettatura cellulare. I dati delle particelle di compensazione del citometro a flusso vengono utilizzati per applicare una correzione alle misurazioni dell'intensità di fluorescenza. Questo protocollo descrive la preparazione e la purificazione di perle di compensazione del polistirene funzionanti covalentemente con il reagente fluorescente meso-tetra(4-carbossifenil) porfina (TCPP) e la loro applicazione nella compensazione della citometria a flusso. In questo lavoro, le perle di polistirene funzionalizzate con ammina sono state trattate con TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC (N-(3-dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato) a pH 6 e a temperatura ambiente per 16 ore con agitazione. Le perle TCPP sono state isolate mediante centrifugazione e risospese in un tampone pH 7 per lo stoccaggio. Il particolato correlato al TCPP è stato osservato come sottoprodotto. Il numero di questi particolati potrebbe essere ridotto utilizzando un protocollo di filtrazione opzionale. Le perle TCPP risultanti sono state utilizzate con successo su un citometro a flusso per la compensazione in esperimenti con cellule di espettorato umano etichettate con più fluorofori. Le perle TCPP si sono dimostrate stabili dopo la conservazione in frigorifero per 300 giorni.
Introduzione
Le porfirine sono di interesse da molti anni in campo biomedico grazie alla loro fluorescenza e alle proprietà tumorali 1,2,3. Le applicazioni terapeutiche come la terapia fotodinamica (PDT) e la terapia sonodinamica (SDT) comportano la somministrazione sistemica di una porfirina a un paziente oncologico, l'accumulo del farmaco nel tumore e l'esposizione localizzata del tumore a una luce laser di una specifica lunghezza d'onda o ultrasuoni. L'esposizione alla luce laser o agli ultrasuoni porta alla generazione di specie reattive dell'ossigeno da parte della porfirina e alla s....
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Protocollo
Tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati.
1. Preparazione della soluzione madre TCPP, 1,0 mg / ml
NOTA: Questo può essere preparato mensilmente.
- Utilizzando una bilancia analitica, una spatola e una carta da pesata, pesare 49,0-50,9 mg di TCPP. Arrotondare il peso a 1/10 di milligrammo. Mettere da parte la quantità misurata di TCPP al riparo dalla luce.
NOTA: Utilizzare una pistola statica se la lettura del peso è instabile. - Determinare le quantità richieste di acqua purificata e isopropanolo (IPA) dalla Tabella....
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Risultati
Questo protocollo per l'etichettatura TCPP delle perline è relativamente veloce ed efficiente. La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo del processo di marcatura delle perline TCPP determinato dalla citometria a flusso. La Figura 1A mostra il profilo standardizzato delle perline arcobaleno, come rilevato nel canale appropriato per il rilevamento di TCPP. Queste perle servono come QC per la standardizzazione delle tensioni laser per il rilevamento di TCPP .......
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Discussione
Nonostante le numerose applicazioni delle porfirine nella diagnosi e nella terapia del cancro2, esiste una letteratura limitata sul loro potenziale uso come reagente citometrico a flusso per l'identificazione di popolazioni cellulari cancerose e non cancerose nei tessuti umani primari24,25,26. La nostra ricerca sull'analisi citometrica a flusso dell'espettorato umano24,27
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Dichiarazioni
Tutti gli autori sono dipendenti di bioAffinity Technologies.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare David Rodriguez per l'assistenza con la preparazione della figura e Precision Pathology Services (San Antonio, TX) per l'uso del suo citometro a flusso Navios EX.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fiale di plastica ambrata, 2 mL, fondo U, polipropilene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Perle di polistirene divinilbenzene reticolato (PS/DVB) con funzione amminica, 10.6 μ m diametro, 2,5% p/v sospensione acquosa, 3,82 x 107 perline/mL, 7,11 x 1011 gruppi amminici/ perlina | Spherotech | APX-100-10 | Diametro spec. 8,0-12,9 um, sospensione 2,5% p/v 3,82 x 107 perline/mL, 7,11 x 1011 gruppi amminici/ perline |
| Tubi conici, 50 mL, Centrifuga | |||
| con rotore appropriato | |||
| 98% | Sigma | 03450-1G | Numero CAS: 25952-53-8 |
| Software di analisi a singola cellula FlowJo (v10.6.1) | BD | ||
| Vetrini coprioggetti, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Filtri per siringhe in fibra di vetro (Finneran, 5 &; m, diametro 13 mm) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Vetrini per microscopio in vetro, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanolo, grado ACS | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Pipetta meccanica, 1 canale, 100-1000 uL con punte | Eppendorf | ||
| MES (acido 22- (N- mopholino)- N'- etansolfonico, sale emisodico | Sigma | M0164 | N. CAS: 117961-21-4 |
| Citometro a flusso Navios EX | Beckman Coulter | ||
| Microscopio Olympus BX-40 con fotocamera DP73 e obiettivo 40X con software cellSens | Pipette Olympus | o simili | |
| Pasteur, vetro, 5,75" | Misuratore di pH Scientific | 13-678-6B | |
| (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipetta controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| , 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| particelle di polistirene (non funzionalizzate), SPHERO, 2,5% p/v, 8,0-12,9 &; m | Spherotech | PP-100-10 | |
| Provette in polipropilene, 15mL, coniche | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Provette in polistirene, fondo tondo | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Perline arcobaleno (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Pipette sierologiche, monouso - 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Pipette sierologiche, monouso - 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) | Sigma | S6014 | Numero CAS: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carbossifenil)porfina) Frontiera Scientifica | Fisher Scientific | 50-393-68 | N. CAS: 14609-54-2 |
| Lettore di piastre Tecan Spark (o simile) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher | Scientific 2215365 |
Riferimenti
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as d....
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Ristampe e permessi
