Detta protokoll demonstrerar mätningar av ytförstärkt Raman-spridning (SERS) med hjälp av en DNA-origami nanoantenn (DONA) kombinerat med samlokaliserad atomkraftmikroskopi (AFM) och Raman-mätningar.
Ytförstärkt Ramanspridning (SERS) har förmågan att detektera enskilda molekyler för vilka hög fältförbättring krävs. Single-molecule (SM) SERS kan tillhandahålla molekylspecifik spektroskopisk information om enskilda molekyler och ger därför mer detaljerad kemisk information än andra SM-detektionstekniker. Samtidigt finns det potential att riva upp information från SM-mätningar som förblir dolda i Raman-mätningar av bulkmaterial. Detta protokoll beskriver SM SERS-mätningarna med hjälp av en DNA-origami nanoantenn (DONA) i kombination med atomkraftmikroskopi (AFM) och Raman-spektroskopi. En DNA-origami-gaffelstruktur och två guldnanopartiklar kombineras för att bilda DONA, med ett mellanrum på 1,2-2,0 nm mellan dem. Detta möjliggör en upp till 1011-faldig SERS-signalförstärkning, vilket möjliggör mätningar av enskilda molekyler. Protokollet demonstrerar vidare placeringen av en enda analytmolekyl i en SERS-hotspot, processen för AFM-avbildning och den efterföljande överlagringen av Raman-avbildning för att mäta en analyt i en enda DONA.
DNA-origami är en nanoteknikteknik som innebär att DNA-strängar viks i specifika former och mönster. Möjligheten att skapa strukturer med exakt kontroll på nanoskala är en av de viktigaste fördelarna med DNA-origami1. Förmågan att manipulera materia i så liten skala har potential att revolutionera ett brett spektrum av områden, inklusive medicin, elektronik och materialvetenskap2. Till exempel har DNA-origamistrukturer använts för att leverera läkemedel direkt till cancerceller3,4, skapa sensorer i nanoskala för att upptäcka sjukdomar5,6 och skapa invecklade mönster på ytorna av material 6,7. Dessutom har förmågan att använda DNA-origami för att skapa komplexa strukturer i nanoskala skapat nya möjligheter att studera grundläggande biologiska processer på nanoskala8.
Surface enhanced Raman scattering (SERS) är en robust analysteknik som detekterar och identifierar molekyler vid extremt låga koncentrationer9. Den är baserad på Raman-effekten, som är en förändring i våglängden för spritt ljus10. SERS kräver ett plasmoniskt metallsubstrat för att förbättra Raman-signalen av molekyler adsorberade på den. Denna förbättring kan vara upp till 10 11 gånger större än signalen som erhålls från samma molekyl mätt med konventionell Raman-spektroskopi, vilket gör SERS till en mycket känslig metod för att analysera spårmängder av ämnen11.
Raman-signalförstärkningen av nanopartiklar beror främst på elektromagnetisk förbättring baserad på excitation av lokaliserad ytplasmonresonans (LSPR)12. I detta fenomen svänger elektroner inom metallnanopartikeln kollektivt runt ytan av metallnanopartikeln under ljusincidens. Detta resulterar i skapandet av en stående våg av elektroner som kallas en ytplasmon, som kan resonera med det infallande ljuset. LSPR förbättrar kraftigt det elektriska fältet nära partikelns yta, och partikelns optiska absorption är maximal vid plasmonresonansfrekvensen. Ytplasmonens energi beror på formen och storleken på metallnanopartikeln, liksom egenskaperna hos det omgivande mediet13. En högre förbättring kan uppnås ytterligare genom plasmoniska kopplingar, till exempel när två nanopartiklar är nära varandra på ett avstånd av cirka 2,5 gånger diameterlängden eller mindre14. Närheten gör att LSPR för båda nanopartiklarna interagerar med varandra, vilket förbättrar det elektriska fältet i gapet mellan partiklarna med flera storleksordningar, vilket långt överstiger förbättringen av en enda nanopartikel15,16,17. Storleken på förbättringen är omvänt proportionell mot avståndet mellan nanopartiklarna; När avståndet minskar visas en kritisk punkt där förstärkningen är tillräcklig för att detektera enskilda molekyler (SM)18.
DNA-origami representerar en nyckelteknik som effektivt kan ordna plasmoniska nanopartiklar för att utnyttja och optimera plasmonisk koppling19. Samtidigt kan molekyler av intresse placeras exakt på den plats där optisk detektering är mest effektiv. Detta har visats med DNA-origamibaserade plasmoniska nanoantenner för fluorescensdetektion20. I motsats till detektion av fluorescerande etiketter ger SERS möjligheten att detektera ett direkt kemiskt fingeravtryck av en molekyl, vilket gör SERS med en molekyl mycket attraktiv för avkänning samt övervakning av kemiska reaktioner och mekanistiska studier. DNA-origami kan också användas som en mask för att tillverka plasmoniska nanostrukturer med väldefinierade former21, även om möjligheten att placera målmolekyler exakt i hot spot då går förlorad.
Med hjälp av samlokaliserad atomkraftmikroskopi (AFM) och Raman-mätningar kan vi erhålla Raman-spektra från en enda DNA-origami nanoantenn (DONA) och potentiellt en enda molekyl om den placeras vid positionen för högsta signalförbättring. DONA består av en DNA-origamigaffel och två exakt placerade nanopartiklar, helt belagda med DNA som kompletterar förlängda stapelsträngar fästa vid DNA-origami. Vid DNA-hybridisering binds nanopartiklarna till DNA-origami-gaffeln med ett mellanrum på 1,2-2,0 nm mellan nanopartikelytorna22. Sådan sammansättning skapar en hot spot mellan nanopartiklarna med en signalförstärkning på upp till 1011 gånger, beräknat från FDTD-simuleringar (finite difference time domain)22, vilket möjliggör SM SERS-mätningar. Volymen av den högsta förbättringen är emellertid liten (i intervallet 1-10 nm3 ), och följaktligen måste målmolekylerna placeras exakt i denna heta plats. DNA-origami-gaffeln möjliggör positionering av en enda molekyl mellan de två nanopartiklarna med hjälp av en DNA-gaffelbrygga och lämplig kopplingskemi. Ändå är det mycket utmanande att observera sådana SM i Raman-spektra22. Alternativt kan nanopartiklarna beläggas helt med målmolekylen, såsom ett TAMRA-färgämne, för att möjliggöra enstaka DONA-mätningar med en högre SERS-intensitet21. I detta fall är TAMRA kovalent fäst vid DNA-beläggningssträngen (figur 1).
SM SERS är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för forskare att studera beteendet och interaktionerna mellan enskilda molekyler i ett prov1. En sådan teknik möjliggör analys av system på en aldrig tidigare skådad känslighetsnivå, vilket ger nya insikter i det grundläggande beteendet hos enskilda molekyler och fördelningen av kemiska eller fysikaliska egenskaper över ett ensemble av molekyler och hjälper till att identifiera relevanta intermediärer i kemiska processer. Att placera en enda molekyl i hot spot samtidigt som man ser till att hot spot har tillräckligt med ytförbättring kan dock vara ganska utmanande27. De beskrivna DONAs i detta protokoll kan exakt placera en enda molekyl i hot spot mellan två guldnanopartiklar samtidigt som en 1011-faldig ytförbättring uppnås.
Gapet mellan nanopartiklarna är avgörande för att DONA-enheten ska nå den nödvändiga ytförbättringen för SM SERS-studier. DONAs är optimerade för sfäriska nanopartiklar med storlekar mellan 60 och 80 nm. Dessutom kan nanopartiklarnas kvalitet avsevärt påverka hybridiseringen av nanopartiklarna med DNA-origamigafflarna; När nanopartiklarna som används i beläggningssteget är äldre än 6 månader börjar effektiviteten av hybridisering minska.
En annan kritisk aspekt av protokollet är att stegen som kräver ett exakt förhållande mellan komponenter måste följas exakt, annars kommer DONAs inte att bildas korrekt. DNA-origamigaffeln är extremt känslig för temperaturrampningsprotokollet, med förändringar som påverkar strukturens integritet eller förhindrar att gafflar bildas.
Amorf kolgenerering är ett viktigt problem under SERS-mätningar eftersom dess toppar vanligtvis ligger i samma intervall som fingeravtrycksområdet för många molekyler (1 200-1 700 cm-1). Även om formationen ännu inte är helt förstådd, är den vanligtvis förknippad med hög lasereffekt eller långa integrationstider28. Som en försiktighetsåtgärd bör lägsta möjliga lasereffekt och kortast möjliga integrationstid användas. Detta är dock inte lätt att uppnå eftersom en balans måste uppnås mellan att erhålla den önskade SERS-signalen och undvika generering av amorft kol.
DONAs är mycket mångsidiga som ett SM-system när det gäller olika typer och former av nanopartiklar som kan användas, såsom silversfärer, guldblommor eller stjärnor. Dessutom kan molekylen som undersöks enkelt ersättas genom att endast ändra DNA-strängen i mitten av bron, utan ändringar i proceduren. Byte till proteiner som cytokrom C kan göras genom att ha en pyridinmodifierad DNA-fångststräng i bron, vilket skulle binda cytokrom C och säkerställa att det är på hot spot för SM SERS-mätningar22. Detta innebär också att flexibelt välja laser för bestrålning, eventuellt med hjälp av en laser som ger maximal förbättring.
Sammanfattningsvis är denna metod tillförlitlig för att montera DONA-strukturer och använda dem för ytförstärkta Raman-spektroskopimätningar med en molekyl.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Europeiska forskningsrådet (ERC; konsoliderare Grant No. 772752).
100 kDa MWCO Amicon filters, 0.5 mL | Merck | UFC5100BK | |
10x TAE buffer (0.4 M Tris, 0.2 M acetic acid, 0.01 M EDTA) | SIGMA Aldrich | T9650 | |
60 nm goldspheres, bare (citrate) | NanoComposix | AUCN60 | |
ACCESS-NC-A AFM probes | SCHAEFER-TEC | ||
Agarose powder | SIGMA Aldrich | 9012-36-6 | |
AuNP DNA coating strands | IDT | ||
AuNP DNA coating strands (TAMRA) | SIGMA Aldrich | ||
Glycerol | SIGMA Aldrich | 56-81-5 | |
Heraeus Fresco 17 centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution | HORIBA | ||
Magnesium chloride | SIGMA Aldrich | 7786-30-3 | |
Nanofork DNA bridge strand (TAMRA) | Metabion | ||
Nanofork DNA staple strands | SIGMA Aldrich | ||
ParafilmM | Carl Roth | CNP8.1 | |
Primus 25 Thermocycler | Peqlab/VWR | ||
Silicon wafer | Siegert wafer | BW14076 | |
Single-stranded scaffold DNA, type p7249 (M13mp18) | Tilibit nanosystems | ||
TCEP solution | SIGMA Aldrich | 51805-45-9 |