Funktionel stedstyret fluorometri i indfødte celler til undersøgelse af skeletmuskulaturens excitabilitet
Summary
Funktionel stedstyret fluorometri er en metode til at studere proteindomænebevægelser i realtid. Modifikation af denne teknik til dens anvendelse i indfødte celler tillader nu detektion og sporing af enkeltspændingssensorbevægelser fra spændingsstyrede Ca2+ kanaler i murinisolerede skeletmuskelfibre.
Abstract
Funktionel stedstyret fluorometri har været den valgte teknik til at undersøge struktur-funktionsforholdet mellem adskillige membranproteiner, herunder spændingsstyrede ionkanaler. Denne tilgang er primært blevet brugt i heterologe ekspressionssystemer til samtidig måling af membranstrømme, den elektriske manifestation af kanalernes aktivitet og fluorescensmålinger, der rapporterer lokale domæneomlægninger. Funktionel stedrettet fluorometri kombinerer elektrofysiologi, molekylærbiologi, kemi og fluorescens i en enkelt vidtrækkende teknik, der tillader undersøgelse af strukturelle omlejringer i realtid og funktion gennem henholdsvis fluorescens og elektrofysiologi. Typisk kræver denne tilgang en konstrueret spændingsstyret membrankanal, der indeholder en cystein, der kan testes af et thiolreaktivt fluorescerende farvestof. Indtil for nylig blev den thiol-reaktive kemi, der blev anvendt til stedrettet fluorescerende mærkning af proteiner, udelukkende udført i Xenopus-oocytter og cellelinjer, hvilket begrænsede omfanget af tilgangen til primære ikke-excitable celler. Denne rapport beskriver anvendeligheden af funktionel stedrettet fluorometri i voksne skeletmuskelceller til at studere de tidlige trin i excitationskontraktionskobling, den proces, hvorved muskelfiberelektrisk depolarisering er forbundet med aktiveringen af muskelkontraktion. Denne protokol beskriver metoderne til at designe og transfektere cystein-manipulerede spændingsstyrede Ca2+ kanaler (CaV1.1) til muskelfibre i flexor digitorum brevis hos voksne mus ved hjælp af in vivo elektroporation og de efterfølgende trin, der kræves til funktionelle stedrettede fluorometrimålinger. Denne tilgang kan tilpasses til at studere andre ionkanaler og proteiner. Brugen af funktionel stedrettet fluorometri af pattedyrs muskel er særlig relevant for at studere grundlæggende mekanismer for excitabilitet.
Introduction
Evnen til at spore ionkanalkonformationelle omlejringer som reaktion på en kendt elektrisk stimulus i en levende celle er en kilde til værdifuld information til molekylær fysiologi1. Spændingsstyrede ionkanaler er membranproteiner, der registrerer ændringer i transmembranspænding, og deres funktion påvirkes også af spændingsændringer2. Udviklingen af spændingsklemmeteknikker i det sidste århundrede tillod fysiologer at studere ioniske strømme i realtid båret af spændingsstyrede ionkanaler som reaktion på membrandepolarisering3. Brugen af spændingsklemmeteknologi har været afgørende for at forstå de elektriske egenskaber af excitable celler som neuroner og muskler. I 1970’erne tillod spændingsklemmeraffinering detektion af gatingstrømme (eller ladningsbevægelse) i spændingsstyret calcium (Ca V) og natrium (NaV) kanaler 4,5. Gating strømme er ikke-lineære kapacitive strømme, der opstår fra bevægelsen af spændingssensorer som reaktion på ændringer i det elektriske felt over cellemembranen6. Gating strømme betragtes som en elektrisk manifestation af molekylære omlejringer, der går forud for eller ledsager ionkanalåbning7. Mens disse strømmålinger giver værdifuld information om kanalens funktion, er både ioniske strømme og gatingstrømme indirekte aflæsninger af inter- og intramolekylære konformationelle omlejringer af spændingsstyrede kanaler7.
Funktionel stedrettet fluorometri (FSDF; også kaldet spændingsklemmefluorometri, VCF) blev udviklet i begyndelsen af 1990’erne8 og gav for første gang mulighed for direkte at se lokale konformationsændringer og funktionen af et kanalprotein i realtid. Ved hjælp af en kombination af kanalmutagenese, elektrofysiologi og heterologe ekspressionssystemer er det muligt fluorescerende at mærke og spore de bevægelige dele af specifikke kanaler eller receptorer som reaktion på den aktiverende stimulus 9,10. Denne fremgangsmåde er blevet flittigt anvendt til at studere spændingsfølermekanismerne i spændingsstyrede ionkanaler 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. For autoritative gennemgange, se 10,20,21,22,23.
Ca V- og NaV-kanalerne, der er kritiske for initiering og udbredelse af elektriske signaler, består af en α1-hovedunderenhed, som har en central pore og fire ikke-identiske spændingsfølerdomæner2. Ud over deres særskilte primære struktur udtrykkes Ca V- og NaV-kanaler som multiunderenhedskomplekser med hjælpeunderenheder24. Spændingsafhængige kaliumkanaler (K V) består af fire underenheder, der ligner et enkelt domæne af Na V eller CaV25. Den poredannende og spændingsfølende α1-underenhed af Ca V- og NaV-kanaler dannes af et enkelt polypeptid, der koder for fire individuelle domæner af seks unikke transmembransegmenter (S1-S6; Figur 1A) 24,26. Regionen bestående af S1 til S4 transmembransegmenter danner spændingssensordomænet (VSD), og S5 og S6 transmembransegmenter danner poredomænet26. I hver VSD indeholder S4 α-helixen positivt ladet arginin eller lysin (figur 1A, B), der bevæger sig som reaktion på membrandepolarisering7. Flere årtiers forskning og resultaterne fra meget forskellige eksperimentelle tilgange understøtter forudsætningen om, at S4-segmenter bevæger sig udad og genererer gatingstrømme som reaktion på membrandepolarisering6.
FSDF måler fluorescensændringerne af et thiolreaktivt farvestof konjugeret med en specifik cysteinrest (dvs. S4-α-helixen) på en ionkanal eller andet protein, konstrueret via stedrettet mutagenese, da kanalen fungerer som reaktion på membrandepolarisering eller andre stimuli10. Faktisk blev FSDF oprindeligt udviklet til at undersøge, om S4-segmentet i KV-kanaler, foreslået at være kanalens hovedspændingssensor, bevæger sig, når gatingladningerne bevæger sig som reaktion på ændringer i membranpotentiale 8,10. I tilfælde af spændingsstyrede ionkanaler kan FSDF løse uafhængige konformationelle omlejringer af de fire VSD’er (sporing af en VSD til enhver tid) samtidig med kanalfunktionsmålinger. Ved hjælp af denne tilgang har det faktisk vist sig, at individuelle frekvensomformere synes at være forskelligt involveret i specifikke aspekter af kanalaktivering og inaktivering 12,27,28,29,30. Det er yderst relevant at identificere hver VSD’s bidrag til kanalernes funktion og kan bruges til yderligere at belyse kanaldriften og potentielt identificere nye mål for lægemiddeludvikling.
Brugen af FSDF i heterologe ekspressionssystemer har været yderst nyttig til at fremme vores forståelse af kanalfunktion fra et reduktionistisk perspektiv10,23. Som mange reduktionistiske tilgange giver den fordele, men har også begrænsninger. For eksempel er en væsentlig begrænsning den delvise rekonstitution af kanalens nanomiljø i det heterologe system. Ofte interagerer ionkanaler med adskillige tilbehørsunderenheder og adskillige andre proteiner, der ændrer deres funktion31. I princippet kan forskellige kanaler og deres tilbehørsunderenheder udtrykkes i heterologe systemer ved anvendelse af flere proteinkodende konstruktioner eller polycistroniske plasmider, men deres oprindelige miljø kan ikke rekonstitueres fuldt ud30,32.
Vores gruppe offentliggjorde for nylig en variant af FSDF i indfødte dissocierede skeletmuskelfibre til undersøgelse af tidlige trin i excitationskontraktionskobling (ECC)33,34, den proces, hvorved muskelfiberelektrisk depolarisering er forbundet med aktiveringen af muskelkontraktion 35,36. For første gang tillod denne tilgang bevægelsessporing af individuelle S4-spændingssensorer fra den spændingsstyrede L-type Ca2+ kanal (CaV1.1, også kendt som DHPR) i det oprindelige miljø i en voksen differentieret muskelfiber37. Dette blev opnået ved at overveje flere egenskaber ved denne celletype, herunder cellens elektriske aktivitet, der muliggør hurtig stimuleringsinduceret selvformeret depolarisering, evnen til at udtrykke cDNA-plasmid gennem di vivo-elektroporation, den naturlige høje ekspression og rumorganisering af kanalerne i cellen og dens kompatibilitet med højhastighedsbilleddannelse og elektrofysiologiske optageenheder. Tidligere brugte vi et højhastighedslinjescanningskonfokalmikroskop som detekteringsenhed37. Nu præsenteres en variation af teknikken ved hjælp af en fotodiode til signaloptagelse. Dette fotodiodebaserede detektionssystem kan lette implementeringen af denne teknik i andre laboratorier.
Her beskrives en trinvis protokol til udnyttelse af FSDF i native celler til undersøgelse af individuel spændingssensorbevægelse fra CaV1.1. Mens CaV1.1-kanalen er blevet brugt som et eksempel i hele dette manuskript, kunne denne teknik anvendes på ekstracellulært tilgængelige domæner af andre ionkanaler, receptorer eller overfladeproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrives en trinvis protokol til udførelse af FSDF i muskelfibre til undersøgelse af individuelle spændingssensorbevægelser fra CaV1.1-kanalen. Selvom antallet af trin og mangfoldigheden af tilgange, der kombineres i denne teknik, kan virke kompleks, anvendes de fleste af disse teknikker ofte rutinemæssigt i biofysiker/cellebiologlaboratorier. Den tilsyneladende kompleksitet ligger således hovedsagelig i kombinationen af alle de forskellige tilgange i en enkelt integreret teknik. Ofte når man udfø…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) for at dele EGFP-CaV1.1 (kanin) vildtypeplasmid. Vi takker Yale Department of Physiology Electronics Laboratory og især Henrik Abildgaard for design og konstruktion af fotodioden med track and hold kredsløb. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud R01-AR075726 og R01-NS103777
Materials
| Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
| 0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
| 1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
| 1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
| 35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
| 60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
| Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
| Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
| Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
| Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
| BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
| collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
| Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
| Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
| EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
| Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
| EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
| FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
| glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
| Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
| Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
| Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
| Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
| LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
| Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
| MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
| OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
| Photodiode | Custom Made | NA | |
| PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
| Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
| Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
| Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
| Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
| S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
| Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
| Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
| Voltage generator | Custom Made | NA |
Riferimenti
- Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
- Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
- Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
- Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
- Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
- Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
- Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
- Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
- Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
- Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
- Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
- Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
- Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
- Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
- Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
- Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
- Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
- Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
- MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
- Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
- Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
- Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
- Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
- Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915 (2021).
- Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
- Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
- Beam, K. G., Horowicz, P. . Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , (2004).
- Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. . Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , 811-822 (2012).
- Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22 (2018).
- Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118 (2021).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520 (2009).
- Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
- Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6 (2016).
- Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
- Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
- Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
- Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
- Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
- Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
- Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109 (2022).
