Vurdering af affilicid virkning af entomopatogene svampe mod partenogenetisk insekt, sennepbladlus, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Denne protokol præsenterer et optimeret løsrevet bladbioassaysystem til evaluering af effektiviteten af entomopatogene svampe (EPF) mod sennepbladlus (Lipaphis erysimi (Kalt.)), Et parthenogenetisk insekt. Metoden skitserer dataindsamlingsprocessen under petriskålforsøg, hvilket gør det muligt for forskere konsekvent at måle virulensen af EPF mod sennepbladlus og andre parthenogenetiske insekter.
Abstract
Sennepbladlusen (L. erysimi) er et skadedyr, der angriber forskellige korsblomstrede afgrøder og overfører plantevirus. For at opnå miljøvenlig skadedyrsbekæmpelse er entomopatogene svampe (EPF) potentielle mikrobielle bekæmpelsesmidler til bekæmpelse af dette skadedyr. Derfor er virulensscreening af EPF-isolater under petriskålforhold nødvendig før feltpåføring. Imidlertid er sennepbladlusen et parthenogenetisk insekt, hvilket gør det vanskeligt at registrere data under petriskålforsøg. Et modificeret system til løsrevne blade bioassays blev udviklet for at løse dette problem ved hjælp af en mikrosprøjte til at inokulere konidier på bladlus og forhindre drukning ved at lette lufttørring efter sporesuspension. Systemet opretholdt høj relativ luftfugtighed i hele observationsperioden, og bladskiven forblev frisk i over ti dage, hvilket tillod parthenogenetisk reproduktion af bladlusene. For at forhindre opbygning af afkom blev der implementeret en proces med daglig fjernelse ved hjælp af en malebørste. Denne protokol demonstrerer et stabilt system til evaluering af virulensen af EPF-isolater mod sennepsbladlus eller andre bladlus, hvilket gør det muligt at vælge potentielle isolater til bladlusbekæmpelse.
Introduction
Sennepbladlusen (L. erysimi) er et berygtet skadedyr, der angriber en række korsblomstrede afgrøder, hvilket forårsager betydelige økonomiske tab1. Selv om flere systematiske insekticider er blevet anbefalet til bekæmpelse af bladlusangreb, giver den hyppige anvendelse af disse insekticider anledning til bekymring med hensyn til pesticidresistens 2,3. Med hensyn til miljøvenlig bekæmpelse af skadegørere kan entomopatogene svampe (EPF) derfor tjene som en passende alternativ bekæmpelsesstrategi. EPF er et insektpatogen med evnen til at inficere værter ved at trænge ind i deres neglebånd, hvilket gør det til et potent middel til bekæmpelse af bladlus og andre plantesugende insekter4. Desuden har EPF vist sig at være en gennemførlig og bæredygtig skadedyrsbekæmpelsesteknik, der tilbyder fordele såsom plantepatogenantagonisme og plantevækstfremme5.
EPF kan opnås gennem lokkemad til insektjord eller isoleres fra insektkadavere imarken 6,7. Før yderligere anvendelse af svampeisolater er patogenicitetsscreening imidlertid nødvendig. Der er foretaget flere undersøgelser af effektiviteten af EPF mod bladlus, som er betydelige afgrøde skadedyr, der kan forårsage alvorlig skade 8,9. Sennepbladlus, blandt forskellige arter af bladlus, er blevet testet for modtagelighed for flere stammer af Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. og endda Alternaria, som primært er kendt som en saprofytisk og plantepatogen svamp, men har vist nogle dødelige virkninger mod sennepbladlus10,11,12.
For at evaluere effektiviteten af EPF mod bladlus under laboratoriebetingelser kan bioassays opdeles i to hoveddele: podningskammeret og svampeinokulation. Den nuværende protokol beskriver konstruktionen af et podningskammer, hvor bladlus kan opretholdes ved hjælp af forskellige metoder såsom et udskåret blad med en petiole indpakket i fugtig bomuld, en udskåret bladskive med en petriskål foret med dæmpet filterpapir, direkte vedligeholdelse på potteplanter eller en udskåret bladskive indlejret i vandagar i en petriskål eller beholder10. 11,13. Almindelige metoder til svampeinokulation inkluderer konidisprøjtning, bladlusnedsænkning i en konidiasuspension, bladdypning i en konidiasuspension og planteendofytinokulation11,14,15,16. Mens der findes forskellige podningsmetoder, bør bioassays simulere feltanvendelsesbetingelser. For eksempel i tilfælde af bladdyppet metode12,17 kan effektiviteten af EPF evalueres, men da bladlusene angriber de svampebelastede blade, bliver bladlusens dorsale side, som er et præferentielt penetrationssted, normalt ikke udsat for svampen.
For at evaluere EPF’s afdragicide virkning under laboratoriebetingelser foreslår denne protokol at anvende den løsrevne bladmetode beskrevet af Yokomi og Gottwald18 med nogle modifikationer efterfulgt af konidiainokulation ved hjælp af en mikrosprøjte. Denne metode opretholder ca. 100% fugtighed i bioassaykammeret i mindst syv dage uden at kræve yderligere genopfyldning af vand18,19. Derudover sikrer begrænsning af bladlus til en overflade, at de udsættes for konidier sprøjtning og letter observationer20. Imidlertid kan bladlus sidde fast i den udsatte agaroverflade, mens de bevæger sig inden for podningskammeret. Desuden kan registrering af data i petriskålforsøget med sennepsbladlus, som er parthenogenetiske insekter, være udfordrende på grund af deres hurtige udvikling og reproduktion. Det er vanskeligt at skelne mellem podede voksne og deres afkom uden fjernelse. Detaljerne om, hvordan man fortsætter med dette trin, nævnes sjældent, og nogle inkonsekvente faktorer, såsom bladforbrugsområde, skal optimeres.
Denne protokol demonstrerer et stabilt system til screening af virulensen af EPF-isolater mod sennepsbladlus, hvilket gør det muligt at vælge potentielle isolater mod forskellige bladlusarter fra et omfattende EPF-bibliotek. Markindsamlede bladlus kan identificeres, og der kan etableres en tilstrækkelig laboratoriepopulation af sennepbladlus til at evaluere den apididicide virkning af forskellige svampeisolater ved hjælp af en nem og gennemførlig metode med ensartede resultater. Bladlus har udviklet flere evolutionære mekanismer som reaktion på intenst og gentaget menneskeskabt pres i agroøkosystemer, hvilket udgør udfordringer for fødevaresikkerheden9. Derfor kan denne beskrevne metode udvides til at evaluere potentielle EPF-isolater mod forskellige bladlusarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Korsblomstrer, en gruppe grøntsager, er ofte angrebet af flere bladlusarter, herunder sennepbladlus (L. erysimi) og kålbladlus (Brevicoryne brassicae)26. Begge arter er blevet rapporteret i Taiwan27, og det er muligt for dem at sameksistere på indsamlingsstedet. For at skelne nært beslægtede bladlusarter anvendte denne undersøgelse en molekylær identifikationsteknik ved hjælp af et multiplexprimersæt21. Ved at designe en mo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
Riferimenti
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
