Avaliação do Efeito Afidicida de Fungos Entomopatogênicos Contra Insetos Partenogenéticos, Pulgão Mostarda, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Este protocolo apresenta um sistema otimizado de bioensaio foliar destacado para avaliar a eficácia de fungos entomopatogênicos (FPE) contra o pulgão mostarda (Lipaphis erysimi (Kalt.)), um inseto partenogenético. O método descreve o processo de coleta de dados durante os experimentos com placas de Petri, permitindo que os pesquisadores meçam consistentemente a virulência do PFE contra pulgões da mostarda e outros insetos partenogenéticos.
Abstract
O pulgão da mostarda (L. erysimi) é uma praga que infesta várias culturas crucíferas e transmite vírus de plantas. Para alcançar o manejo ecológico de pragas, fungos entomopatogênicos (FPE) são potenciais agentes de controle microbiano para o controle dessa praga. Portanto, a triagem de virulência de isolados de PFE em condições de placa de Petri é necessária antes da aplicação em campo. No entanto, o pulgão da mostarda é um inseto partenogenético, dificultando o registro de dados durante experimentos com placas de Petri. Um sistema modificado para bioensaios de folhas destacadas foi desenvolvido para resolver essa questão, usando um micropulverizador para inocular conídios em pulgões e prevenir o afogamento, facilitando a secagem ao ar após a suspensão dos esporos. O sistema manteve alta umidade relativa durante todo o período de observação, e o disco foliar permaneceu fresco por mais de dez dias, permitindo a reprodução partenogenética dos pulgões. Para evitar o acúmulo de filhotes, foi implementado um processo de remoção diária com pincel de pintura. Este protocolo demonstra um sistema estável para avaliar a virulência de isolados de PFE contra pulgões mostarda ou outros afídeos, possibilitando a seleção de potenciais isolados para o controle de afídeos.
Introduction
O pulgão-mostarda (L. erysimi) é uma notória praga que infesta uma variedade de culturas crucíferas, causando perdas econômicas significativas1. Embora vários inseticidas sistemáticos tenham sido recomendados para combater infestações por afídeos, o uso frequente desses inseticidas levanta preocupações sobre a resistência a pesticidas 2,3. Portanto, em termos de manejo ecológico de pragas, os fungos entomopatogênicos (PFE) podem servir como uma estratégia alternativa de controle adequada. O PFE é um inseto patógeno com capacidade de infectar hospedeiros penetrando em suas cutículas, tornando-se um potente agente no controle de pulgões e outros insetos sugadores deplantas4. Além disso, o PFE tem se mostrado uma técnica viável e sustentável de manejo de pragas, oferecendo benefícios como antagonismo de fitopatógenos e promoção do crescimento vegetal5.
O PFE pode ser obtido através de iscas de inseto-solo ou isolado de cadáveres de insetos no campo 6,7. No entanto, antes do uso adicional de isolados fúngicos, a triagem de patogenicidade é necessária. Vários estudos têm sido realizados sobre a eficácia do PFE contra pulgões, que são importantes pragas das culturas e podem causar danos severos 8,9. Os pulgões da mostarda, dentre várias espécies de afídeos, têm sido testados quanto à suscetibilidade a várias cepas de Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., e até mesmo Alternaria, que é primariamente conhecida como fungo saprofítico e fitopatogênico, mas tem mostrado alguns efeitos letais contra pulgões mostarda10,11,12.
Para avaliar a eficácia do PFE contra pulgões em condições de laboratório, os bioensaios podem ser divididos em duas partes principais: a câmara de inoculação e a inoculação fúngica. O protocolo actual descreve a construção de uma câmara de inoculação, onde os pulgões podem ser mantidos utilizando vários métodos, tais como uma folha excisada com um pecíolo envolto em algodão húmido, um disco de folha excisado com uma placa de Petri forrada com papel de filtro humedecido, manutenção directa em plantas de vaso ou um disco de folha excisado embutido em ágar água dentro de uma placa de Petri ou recipiente10, 11,13. Métodos comuns para inoculação fúngica incluem pulverização de conídios, imersão de afídeos em suspensão de conídios, imersão foliar em suspensão de conídios e inoculação de endófitos vegetais11,14,15,16. Embora existam vários métodos de inoculação, os bioensaios devem simular as condições de aplicação em campo. Por exemplo, no caso do método de imersão foliar12,17, a eficiência do PFE pode ser avaliada, mas como os pulgões infestam as folhas carregadas de fungo, a face dorsal do pulgão, que é um local preferencial de penetração, geralmente não fica exposta ao fungo.
Para avaliar o efeito afidicida do PFE em condições de laboratório, este protocolo sugere a utilização do método de folhas destacadas descrito por Yokomi e Gottwald18 com algumas modificações, seguido da inoculação de conídios com micropulverizador. Esse método mantém aproximadamente 100% de umidade na câmara de bioensaio por pelo menos sete dias, sem a necessidade de reposição adicional de água18,19. Além disso, o confinamento dos pulgões em uma superfície garante sua exposição à pulverização de conídios e facilita as observações20. No entanto, os pulgões podem ficar presos na superfície exposta do ágar enquanto se movem dentro da câmara de inoculação. Além disso, o registro de dados no experimento da placa de Petri com pulgões da mostarda, que são insetos partenogenéticos, pode ser um desafio devido ao seu rápido desenvolvimento e reprodução. É difícil distinguir entre adultos inoculados e sua progênie sem remoção. Os detalhes de como proceder nessa etapa raramente são mencionados, e alguns fatores inconsistentes, como a área de consumo de folhas, precisam ser otimizados.
Este protocolo demonstra um sistema estável para triagem da virulência de isolados de PFE contra pulgões mostarda, possibilitando a seleção de potenciais isolados contra várias espécies de afídeos a partir de uma extensa biblioteca de PFE. Pulgões coletados em campo podem ser identificados, e uma população laboratorial suficiente de pulgões mostarda pode ser estabelecida para avaliar o efeito afidicida de vários isolados fúngicos usando uma metodologia fácil e viável com resultados consistentes. Os pulgões têm desenvolvido múltiplos mecanismos evolutivos em resposta a intensas e repetidas pressões antrópicas em agroecossistemas, colocando desafios à segurança alimentar9. Portanto, este método descrito pode ser estendido para avaliar potenciais isolados de PFE contra várias espécies de afídeos.
Protocol
Representative Results
Discussion
As crucíferas, um grupo de vegetais, são frequentemente infestadas por várias espécies de afídeos, incluindo o pulgão da mostarda (L. erysimi) e o pulgão do repolho (Brevicoryne brassicae)26. Ambas as espécies foram relatadas em Taiwan27, e é possível que coexistam no local de coleta. Para distinguir espécies de afídeos estreitamente relacionadas, este estudo empregou uma técnica de identificação molecular usando um conjunto de primers multi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo 109-2313-B-005 -048 -MY3 do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
Riferimenti
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