Оценка афидицидного действия энтомопатогенных грибов в отношении партеногенетического насекомого, горчичной тли, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Данный протокол представляет собой оптимизированную систему биотестирования с отрывными листьями для оценки эффективности энтомопатогенных грибов (EPF) против партеногенетического насекомого горчичной тли (Lipaphis erysimi (Kalt.)). Метод описывает процесс сбора данных во время экспериментов с чашкой Петри, что позволяет исследователям последовательно измерять вирулентность EPF против горчичной тли и других партеногенетических насекомых.
Abstract
Горчичная тля (L. erysimi) – вредитель, поражающий различные крестоцветные культуры и передающий вирусы растений. Для достижения экологически чистой борьбы с вредителями энтомопатогенные грибы (EPF) являются потенциальными микробными агентами для борьбы с этим вредителем. Поэтому перед полевым применением необходимо провести скрининг вирулентности изолятов EPF в условиях чашки Петри. Однако горчичная тля является партеногенетическим насекомым, что затрудняет запись данных во время экспериментов с чашкой Петри. Для решения этой проблемы была разработана модифицированная система для биопроб с отделившимися листьями, использующая микроопрыскиватель для инокуляции конидий на тлю и предотвращения утопления, облегчая сушку на воздухе после суспензии спор. Система поддерживала высокую относительную влажность на протяжении всего периода наблюдений, а листовой диск оставался свежим более десяти дней, что позволяло партеногенетического размножения тли. Для предотвращения наращивания потомства был реализован процесс ежедневного удаления с помощью малярной кисти. Этот протокол демонстрирует стабильную систему оценки вирулентности изолятов EPF против горчичной тли или других видов тли, что позволяет выбирать потенциальные изоляты для борьбы с тлей.
Introduction
Горчичная тля (L. erysimi) является печально известным вредителем, который поражает различные крестоцветные культуры, нанося значительный экономический ущерб1. Несмотря на то, что для борьбы с нашествием тлей было рекомендовано несколько систематических инсектицидов, частое использование этих инсектицидов вызывает опасения по поводу устойчивости к пестицидам 2,3. Таким образом, с точки зрения экологически чистой борьбы с вредителями, энтомопатогенные грибы (EPF) могут служить подходящей альтернативной стратегией борьбы. EPF является насекомым-патогеном, способным заражать хозяев, проникая в их кутикулу, что делает его мощным средством для борьбы с тлей и другими насекомыми, сосущими растения4. Кроме того, EPF зарекомендовал себя как осуществимый и устойчивый метод борьбы с вредителями, обеспечивающий такие преимущества, как антагонизм патогенов растений и стимулирование роста растений5.
EPF может быть получен путем травли насекомых или выделен из трупов насекомых в полевых условиях 6,7. Однако перед дальнейшим применением грибковых изолятов необходим скрининг патогенности. Было проведено несколько исследований эффективности EPF против тли, которая является значительным вредителем сельскохозяйственных культур, способным нанести серьезный ущерб 8,9. Горчичная тля, среди различных видов тли, была проверена на восприимчивость к нескольким штаммам Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. и даже Alternaria, который в первую очередь известен как сапрофитный и патогенный гриб для растений, но показал некоторые летальные эффекты против горчичной тли10,11,12.
Для оценки эффективности EPF против тли в лабораторных условиях биопробы можно разделить на две основные части: инокуляционная камера и грибковая инокуляция. В настоящем протоколе описывается строительство инокуляционной камеры, в которой тля может поддерживаться с помощью различных методов, таких как вырезанный лист с черешком, обернутым влажным хлопком, вырезанный листовой диск с чашкой Петри, выстланный влажной фильтровальной бумагой, непосредственное обслуживание горшечных растений или вырезанный листовой диск, погруженный в водный агар в чашке Петри или контейнере10. 11,13. Распространенные методы инокуляции грибов включают опрыскивание конидий, погружение тли в суспензию конидий, погружение листьев в суспензию конидий и инокуляцию эндофитов растений11,14,15,16. Несмотря на то, что существуют различные методы инокуляции, биотесты должны имитировать условия применения в полевых условиях. Например, в случае с методом окунания листьев12,17 можно оценить эффективность EPF, но поскольку тля поражает пораженные грибком листья, спинная сторона тли, которая является предпочтительным местом проникновения, обычно не подвергается воздействию грибка.
Для оценки афидицидного действия EPF в лабораторных условиях в данном протоколе предлагается использовать метод отрывных листьев, описанный Yokomi и Gottwald18, с некоторыми модификациями с последующей инокуляцией конидий с помощью микрораспылителя. Этот метод поддерживает примерно 100% влажность в биопробирной камере не менее семи дней, не требуя дополнительного пополнения водой18,19. Кроме того, ограничение тлей одной поверхностью обеспечивает их подверженность опрыскиванию конидиями и облегчает наблюдения20. Однако тля может застрять на открытой поверхности агара при перемещении внутри инокуляционной камеры. Кроме того, регистрация данных в эксперименте в чашке Петри с горчичными тлями, которые являются партеногенетическими насекомыми, может быть сложной задачей из-за их быстрого развития и размножения. Трудно отличить привитых взрослых особей от их потомства без изъятия. Детали того, как действовать на этом этапе, редко упоминаются, и некоторые противоречивые факторы, такие как площадь потребления листьев, должны быть оптимизированы.
Этот протокол демонстрирует стабильную систему скрининга вирулентности изолятов EPF против горчичной тли, что позволяет выбирать потенциальные изоляты против различных видов тлей из обширной библиотеки EPF. Можно идентифицировать тлю, собранную в полевых условиях, и создать достаточную лабораторную популяцию горчичной тли для оценки афидицидного действия различных грибковых изолятов с использованием простой и осуществимой методологии с последовательными результатами. Тля развила многочисленные эволюционные механизмы в ответ на интенсивное и повторяющееся антропогенное давление на агроэкосистемы, что создает проблемы для продовольственной безопасности9. Таким образом, описанный метод может быть расширен для оценки потенциальных изолятов EPF против различных видов тлей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Крестоцветные, группа овощей, часто поражаются несколькими видами тлей, включая горчичную тлю (L. erysimi) и капустную тлю (Brevicoryne brassicae)26. Оба вида были зарегистрированы на Тайване27, и вполне возможно, что они могут сосуществовать в месте сбора. Для различе?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано 109-2313-B-005 -048 -MY3 Министерством науки и технологий (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
Riferimenti
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
