Entomopatojenik Fungusların Partenogenetik Böcek, Hardal Yaprak Biti, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Bu protokol, partenogenetik bir böcek olan hardal yaprak bitine (Lipaphis erysimi (Kalt.)) karşı entomopatojenik mantarların (EPF) etkinliğini değerlendirmek için optimize edilmiş bir müstakil yaprak biyo-tahlil sistemi sunar. Yöntem, Petri kabı deneyleri sırasında veri toplama sürecini özetleyerek, araştırmacıların EPF’nin hardal yaprak bitlerine ve diğer partenogenetik böceklere karşı virülansını tutarlı bir şekilde ölçmelerini sağlar.
Abstract
Hardal yaprak biti (L. erysimi), çeşitli turpgillerden bitkileri istila eden ve bitki virüslerini bulaştıran bir zararlıdır. Çevre dostu haşere yönetimi elde etmek için, entomopatojenik mantarlar (EPF), bu haşereyi kontrol etmek için potansiyel mikrobiyal kontrol ajanlarıdır. Bu nedenle, saha uygulamasından önce Petri kabı koşulları altında EPF izolatlarının virülans taraması gereklidir. Bununla birlikte, hardal yaprak biti partenogenetik bir böcektir ve Petri kabı deneyleri sırasında veri kaydetmeyi zorlaştırır. Bu sorunu çözmek için, yaprak bitlerine konidia aşılamak ve spor süspansiyonundan sonra havayla kurutmayı kolaylaştırarak boğulmayı önlemek için bir mikro püskürtücü kullanarak, müstakil yapraklı biyo-tahliller için değiştirilmiş bir sistem geliştirilmiştir. Sistem, gözlem süresi boyunca yüksek bağıl nemi korudu ve yaprak diski on günden fazla taze kaldı ve yaprak bitlerinin partenogenetik üremesine izin verdi. Yavru oluşumunu önlemek için, bir boyama fırçası kullanarak günlük bir çıkarma işlemi uygulandı. Bu protokol, EPF izolatlarının hardal yaprak bitlerine veya diğer yaprak bitlerine karşı virülansını değerlendirmek için kararlı bir sistem gösterir ve yaprak biti kontrolü için potansiyel izolatların seçilmesini sağlar.
Introduction
Hardal yaprak biti (L. erysimi), çeşitli turpgillerden bitkileri istila eden ve önemli ekonomik kayıplara neden olan kötü şöhretli bir zararlıdır1. Yaprak biti istilasıyla mücadele etmek için birkaç sistematik insektisit önerilmiş olsa da, bu insektisitlerin sık kullanımı pestisit direnciile ilgili endişeleri artırmaktadır 2,3. Bu nedenle, çevre dostu haşere yönetimi açısından, entomopatojenik mantarlar (EPF) uygun bir alternatif kontrol stratejisi olarak hizmet edebilir. EPF, konakçıların tırnak etlerine nüfuz ederek enfekte etme yeteneğine sahip bir böcek patojenidir, bu da onu yaprak bitlerini ve diğer bitki emici böcekleri kontrol etmek için güçlü bir ajan haline getirir4. Ayrıca, EPF’nin uygulanabilir ve sürdürülebilir bir haşere yönetimi tekniği olduğu kanıtlanmıştır ve bitki patojen antagonizması ve bitki büyümesinin teşviki gibi faydalar sunmaktadır5.
EPF, böcek-toprak yemleme yoluyla elde edilebilir veya tarladaki böcek kadavralarından izole edilebilir 6,7. Bununla birlikte, mantar izolatlarının daha fazla kullanılmasından önce, patojenite taraması gereklidir. EPF’nin ciddi hasara neden olabilecek önemli mahsul zararlıları olan yaprak bitlerine karşı etkinliği üzerine çeşitli çalışmalar yapılmıştır 8,9. Hardal yaprak bitleri, çeşitli yaprak biti türleri arasında, Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. ve hatta esas olarak saprofit ve bitki patojenik mantarı olarak bilinen ancak hardal yaprak bitlerine karşı bazı ölümcül etkiler gösteren Alternaria’nın çeşitli suşlarına duyarlılık açısından test edilmiştir10,11,12.
EPF’nin laboratuvar koşullarında yaprak bitlerine karşı etkinliğini değerlendirmek için biyoanalizler iki ana bölüme ayrılabilir: aşılama odası ve mantar aşılaması. Mevcut protokol, yaprak bitlerinin nemli pamuğa sarılmış bir yaprak sapı ile eksize edilmiş bir yaprak, nemli filtre kağıdı ile kaplanmış bir Petri kabına sahip eksize edilmiş bir yaprak diski, saksı bitkileri üzerinde doğrudan bakım veya bir Petri kabı veya kabı10 içindeki su agarına gömülü eksize edilmiş bir yaprak diski gibi çeşitli yöntemler kullanılarak korunabileceği bir aşılama odasının yapımını açıklamaktadır. 11,13. Mantar aşılaması için yaygın yöntemler arasında conidia püskürtme, yaprak bitinin bir conidia süspansiyonuna daldırılması, yaprakların bir conidia süspansiyonuna daldırılması ve bitki endofit aşılaması11,14,15,16 bulunur. Çeşitli aşılama yöntemleri mevcut olsa da, biyo-tahliller saha uygulama koşullarını simüle etmelidir. Örneğin, yaprağa daldırma yöntemi12,17 durumunda, EPF’nin etkinliği değerlendirilebilir, ancak yaprak bitleri mantar yüklü yaprakları istila ettiğinden, tercihli bir penetrasyon bölgesi olan yaprak bitinin dorsal tarafı genellikle mantara maruz kalmaz.
EPF’nin laboratuvar koşullarında yaprak öldürücü etkisini değerlendirmek için, bu protokol, Yokomi ve Gottwald18 tarafından bazı modifikasyonlarla tarif edilen müstakil yaprak yönteminin kullanılmasını ve ardından bir mikro püskürtücü kullanılarak konidia aşılamasının yapılmasını önerir. Bu yöntem, ek su ikmali gerektirmeden en az yedi gün boyunca biyo-tahlil odasında yaklaşık% 100 nemi korur18,19. Ek olarak, yaprak bitlerini tek bir yüzeyle sınırlamak, konidia püskürtmeye maruz kalmalarını sağlar ve gözlemleri kolaylaştırır20. Bununla birlikte, yaprak bitleri, aşılama odası içinde hareket ederken açıkta kalan agar yüzeyinde sıkışabilir. Ayrıca, partenogenetik böcekler olan hardal yaprak bitleri ile Petri kabı deneyinde veri kaydetmek, hızlı gelişimleri ve üremeleri nedeniyle zor olabilir. Aşılanmış yetişkinler ile soyları arasında çıkarmadan ayrım yapmak zordur. Bu adıma nasıl devam edileceğinin ayrıntılarından nadiren bahsedilir ve yaprak tüketim alanı gibi bazı tutarsız faktörlerin optimize edilmesi gerekir.
Bu protokol, EPF izolatlarının hardal yaprak bitlerine karşı virülansını taramak için kararlı bir sistem gösterir ve kapsamlı bir EPF kütüphanesinden çeşitli yaprak biti türlerine karşı potansiyel izolatların seçilmesini sağlar. Tarlada toplanan yaprak bitleri tanımlanabilir ve tutarlı sonuçlarla kolay ve uygulanabilir bir metodoloji kullanılarak çeşitli mantar izolatlarının yaprak öldürücü etkisini değerlendirmek için yeterli bir hardal yaprak biti laboratuvar popülasyonu oluşturulabilir. Yaprak bitleri, tarımsal ekosistemlerdeki yoğun ve tekrarlanan antropojenik baskılara yanıt olarak çoklu evrimsel mekanizmalar geliştirmiş ve gıda güvenliğine zorluklar çıkarmıştır9. Bu nedenle, açıklanan bu yöntem, çeşitli yaprak biti türlerine karşı potansiyel EPF izolatlarını değerlendirmek için genişletilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir grup sebze olan turpgiller, hardal yaprak biti (L. erysimi) ve lahana yaprak biti (Brevicoryne brassicae) dahil olmak üzere birden fazla yaprak biti türü tarafından sıklıkla istila edilir26. Her iki tür de Tayvan27’de rapor edilmiştir ve toplama alanında bir arada bulunmaları mümkündür. Yakından ilişkili yaprak biti türlerini ayırt etmek için, bu çalışmada bir multipleks primer seti21 kullanılarak moleküle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı’ndan (MOST) 109-2313-B-005 -048 -MY3 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
Riferimenti
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
