הערכת ההשפעה של פטריות אנטומופתוגניות נגד חרק פרתנוגנטי, כנימת חרדל, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
פרוטוקול זה מציג מערכת ביו-אסאי אופטימלית של עלים מנותקים להערכת היעילות של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) נגד כנימת החרדל (Lipaphis erysimi (Kalt.)), חרק פרתנוגנטי. השיטה מתארת את תהליך איסוף הנתונים במהלך ניסויים בצלוחית פטרי, ומאפשרת לחוקרים למדוד באופן עקבי את האלימות של EPF נגד כנימות חרדל וחרקים פרתנוגנטיים אחרים.
Abstract
כנימת החרדל (L. erysimi) היא מזיק השורץ גידולים מצליבים שונים ומעביר וירוסים צמחיים. כדי להשיג הדברה ידידותית לסביבה, פטריות אנטומופתוגניות (EPF) הן חומרי הדברה מיקרוביאליים פוטנציאליים להדברת מזיק זה. לכן, יש צורך בבדיקת אלימות של מבודדי EPF בתנאי צלחת פטרי לפני היישום בשטח. עם זאת, כנימת החרדל היא חרק פרתנוגנטי, מה שמקשה על רישום נתונים במהלך ניסויים בצלוחית פטרי. מערכת שונה לבדיקות ביולוגיות של עלים מנותקים פותחה כדי לטפל בבעיה זו, באמצעות מיקרו-מרסס כדי לחסן קונידיה על כנימות ולמנוע טביעה על ידי הקלה על ייבוש באוויר לאחר תרחיף נבגים. המערכת שמרה על לחות יחסית גבוהה לאורך כל תקופת התצפית, ודיסקית העלה נשארה טרייה במשך יותר מעשרה ימים, מה שאפשר רבייה פרתנוגנטית של הכנימות. כדי למנוע הצטברות צאצאים, בוצע תהליך של הסרה יומיומית באמצעות מברשת צביעה. פרוטוקול זה מדגים מערכת יציבה להערכת האלימות של מבודדי EPF נגד כנימות חרדל או כנימות אחרות, ומאפשר בחירה של מבודדים פוטנציאליים להדברת כנימות.
Introduction
כנימת החרדל (L. erysimi) היא מזיק ידוע לשמצה השורץ מגוון גידולים מצליביםוגורם להפסדים כלכליים משמעותיים 1. בעוד שהומלץ על מספר קוטלי חרקים שיטתיים כדי להילחם בנגיעות כנימות, השימוש התכוף בקוטלי חרקים אלה מעלה חששות לגבי עמידות לחומרי הדברה 2,3. לכן, במונחים של הדברה ידידותית לסביבה, פטריות אנטומופתוגניות (EPF) יכולות לשמש כאסטרטגיית הדברה חלופית מתאימה. EPF הוא פתוגן חרקים בעל יכולת להדביק פונדקאים על ידי חדירה לציפורניים שלהם, מה שהופך אותו לסוכן רב עוצמה להדברת כנימות וחרקים מוצצי צמחים אחרים4. יתר על כן, EPF הוכיחה את עצמה כטכניקת הדברה ישימה ובת קיימא, המציעה יתרונות כגון אנטגוניזם לפתוגנים צמחיים וקידום צמיחת צמחים5.
EPF ניתן להשיג באמצעות פיתיון קרקע חרקים או מבודד מגופות חרקים בשדה 6,7. עם זאת, לפני שימוש נוסף של מבודדים פטרייתיים, בדיקת פתוגניות יש צורך. נערכו מספר מחקרים על יעילות EPF נגד כנימות, שהן מזיקות יבול משמעותיות שעלולות לגרום לנזק חמור 8,9. כנימות חרדל, בין מינים שונים של כנימות, נבדקו לרגישות למספר זנים של Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., ואפילו Alternaria, הידועה בעיקר כפטרייה פתוגנית ספרופיטית וצמחית, אך הראתה כמה השפעות קטלניות נגד כנימות חרדל10,11,12.
כדי להעריך את היעילות של EPF נגד כנימות בתנאי מעבדה, bioassays ניתן לחלק לשני חלקים עיקריים: תא החיסון חיסון חיסון פטרייתי. הפרוטוקול הנוכחי מתאר בניית תא חיסון, שבו ניתן לתחזק כנימות בשיטות שונות כגון עלה נכרת עם פטוטרת עטופה בכותנה לחה, דיסק עלה נכרת עם צלחת פטרי מרופדת בנייר פילטר לח, תחזוקה ישירה על עציצים, או דיסק עלה נכרת המוטבע באגר מים בתוך צלחת פטרי או מיכל10, 11,13. שיטות נפוצות לחיסון פטרייתי כוללות ריסוס קונידיה, טבילת כנימות בתרחיף קונידיה, טבילת עלים בתרחיף קונידיה וחיסון אנדופיטיםצמחיים 11,14,15,16. בעוד שקיימות שיטות חיסון שונות, הבדיקות הביולוגיות אמורות לדמות תנאי יישום בשטח. לדוגמה, במקרה של שיטת טבילת עלים12,17, ניתן להעריך את יעילות EPF, אך מכיוון שהכנימות שורצות את העלים עמוסי הפטרייה, הצד הגבי של הכנימה, שהוא אתר חדירה מועדף, אינו נחשף בדרך כלל לפטרייה.
כדי להעריך את ההשפעה של EPF בתנאי מעבדה, פרוטוקול זה מציע להשתמש בשיטת העלה המנותק שתוארה על ידי יוקומי וגוטוולד18 עם כמה שינויים, ואחריה חיסון קונידיה באמצעות מיקרו-מרסס. שיטה זו שומרת על לחות של כ-100% בתא הבדיקה הביולוגית למשך שבעה ימים לפחות ללא צורך בחידוש נוסף של מים18,19. בנוסף, כליאת הכנימות למשטח אחד מבטיחה את חשיפתן לריסוס קונידיה ומקלה על תצפיות20. עם זאת, כנימות עלולות להיתקע במשטח האגר החשוף תוך כדי תנועה בתוך תא החיסון. יתר על כן, רישום נתונים בניסוי צלחת פטרי עם כנימות חרדל, שהן חרקים פרתנוגנטיים, יכול להיות מאתגר בשל התפתחותן והתרבותן המהירה. קשה להבחין בין מבוגרים מחוסנים לצאצאיהם ללא הסרה. הפרטים כיצד להמשיך עם צעד זה מוזכרים לעתים רחוקות, וכמה גורמים לא עקביים, כגון שטח צריכת עלים, צריך להיות אופטימלי.
פרוטוקול זה מדגים מערכת יציבה לסינון האלימות של מבודדי EPF נגד כנימות חרדל, המאפשרת בחירה של מבודדים פוטנציאליים נגד מיני כנימות שונים מתוך ספריית EPF נרחבת. ניתן לזהות כנימות שנאספו בשטח, וניתן להקים אוכלוסיית מעבדה מספקת של כנימות חרדל כדי להעריך את ההשפעה של מבודדי פטריות שונים באמצעות מתודולוגיה קלה וישימה עם תוצאות עקביות. כנימות פיתחו מנגנונים אבולוציוניים מרובים בתגובה ללחצים אנתרופוגניים אינטנסיביים וחוזרים ונשנים במערכות אקולוגיות חקלאיות, מה שמציב אתגרים לביטחון המזון9. לכן, ניתן להרחיב שיטה מתוארת זו כדי להעריך מבודדי EPF פוטנציאליים כנגד מיני כנימות שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המצליבים, קבוצה של ירקות, שורצים לעתים קרובות על ידי מינים רבים של כנימות, כולל כנימת חרדל (L. erysimi) וכנימת כרוב (Brevicoryne brassicae)26. שני המינים דווחו בטייוואן27, וייתכן שהם יתקיימו יחד באתר האיסוף. כדי להבחין בין מיני כנימות קרובים, מחקר זה השתמש בטכניקת זיהוי מו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי 109-2313-B-005 -048 -MY3 ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
Riferimenti
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
