Optogenetisk hemming av rho1-mediert aktomyosinkontraktilitet kombinert med måling av epitelspenning i Drosophila-embryoer

Summary

Actomyosin kontraktilitet spiller en viktig rolle i celle og vev morfogenese. Det er imidlertid utfordrende å manipulere aktomyosinkontraktiliteten in vivo akutt. Denne protokollen beskriver et optogenetisk system som raskt hemmer Rho1-mediert aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoer , og avslører det umiddelbare tapet av epitelspenning etter inaktivering av aktomyosin in vivo.

Abstract

Kontraktile krefter generert av aktin og ikke-muskelmyosin II (“actomyosinkontraktilitet”) er kritiske for morfologiske endringer av celler og vev på flere lengdeskalaer, slik som celledeling, cellemigrasjon, epitelfolding og forgreningsmorfogenese. En grundig forståelse av rollen som aktomyosinkontraktilitet i morfogenese krever tilnærminger som tillater rask inaktivering av aktomyosin, noe som er vanskelig å oppnå ved bruk av konvensjonelle genetiske eller farmakologiske tilnærminger. Den presenterte protokollen demonstrerer bruken av et CRY2-CIBN-basert optogenetisk dimeriseringssystem, Opto-Rho1DN, for å hemme actomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoer med presise tidsmessige og romlige kontroller. I dette systemet er CRY2 smeltet sammen med den dominerende negative formen av Rho1 (Rho1DN), mens CIBN er forankret til plasmamembranen. Blålysmediert dimerisering av CRY2 og CIBN resulterer i rask translokasjon av Rho1DN fra cytoplasma til plasmamembranen, hvor den inaktiverer actomyosin ved å hemme endogen Rho1. I tillegg presenterer denne artikkelen en detaljert protokoll for kobling av Opto-Rho1DN-mediert inaktivering av aktomyosin med laserablasjon for å undersøke rollen til aktomyosin i generering av epitelspenning under Drosophila ventralfuredannelse. Denne protokollen kan brukes på mange andre morfologiske prosesser som involverer aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoer med minimale modifikasjoner. Samlet sett er dette optogenetiske verktøyet en kraftig tilnærming til å dissekere funksjonen av aktomyosinkontraktilitet ved å kontrollere vevsmekanikk under dynamisk vevsremodellering.

Introduction

Aktomyosinkontraktilitet, kontraktilkraften som utøves av ikke-muskelmyosin II (heretter ‘myosin’) på F-aktinnettverket, er en av de viktigste kreftene i å endre celleform og drive vevsnivå morfogenese ^1,2. For eksempel resulterer aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet ved epitelcellens apikale domene i apikal innsnevring, noe som letter en rekke morfogenetiske prosesser, inkludert epitelfolding, celleekstrudering, delaminering og sårheling 3,4,5,6,7 . Aktiveringen av myosin krever fosforylering av dets regulatoriske lykjede. Denne modifikasjonen lindrer den hemmende konformasjonen av myosinmolekylene, slik at de kan danne bipolare myosinfilamentbunter med flere hodedomener i begge ender. De bipolare myosinfilamentene driver den anti-parallelle bevegelsen av aktinfilamenter og resulterer i generering av kontraktil kraft ^1,8,9.

Den evolusjonært bevarte Rho-familiens lille GTPase RhoA (Rho1 i Drosophila) spiller en sentral rolle i aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet i ulike cellulære sammenhenger^10,11. Rho1 fungerer som en bimolekylær bryter ved å binde enten GTP (aktiv form) eller GDP (inaktiv form)¹². Syklusen mellom GTP- eller GDP-bundet Rho1 reguleres av dens GTPase-aktiverende proteiner (GAPs) og guaninnukleotid-utvekslingsfaktorer (GEFs)¹³. GEFs funksjon for å lette utvekslingen av BNP for GTP og dermed aktivere Rho1-aktivitet. GAPs, derimot, forbedrer GTPase-aktiviteten til Rho1 og deaktiverer dermed Rho1. Aktivert Rho1 fremmer aktomyosinkontraktilitet gjennom interaksjon med og aktivering av nedstrøms effektorer, Rho-assosiert kinase (Rok) og Diaphanous¹⁴. Rok induserer myosinaktivering og aktomyosinkontraktilitet ved fosforylering av den regulatoriske lyskjeden til myosin¹⁵. I tillegg hemmer Rok også myosin-regulatorisk lyskjedefosfatase, og fremmer dermed myosinfilamentmontering¹⁶ ytterligere. Rok kan også fosforylere LIM-kinaser, som, når de aktiveres, forhindrer aktindemontering ved fosforylering og hemming av aktin-depolymeriseringsfaktoren kofilin^17,18. Diafanøs er en aktinnukleator i forminfamilien som fremmer aktinpolymerisasjon, noe som gir en base for myosin å interagere med 19,20,21.

Mens de cellulære mekanismene som aktiverer actomyosinkontraktilitet er godt belyst, er vår forståelse av dens funksjon i regulering av dynamisk vevsremodellering fortsatt ufullstendig. Å fylle dette kunnskapsgapet krever tilnærminger som raskt kan inaktivere actomyosin i spesifikke vevsregioner in vivo og registrere den umiddelbare effekten på vevsadferd og egenskaper. Denne protokollen beskriver bruk av en optogenetisk tilnærming for akutt å hemme actomyosinkontraktilitet under Drosophila mesoderminvaginasjon, etterfulgt av måling av epitelspenning ved bruk av laserablasjon. Under Drosophila gastrulering gjennomgår de ventralt lokaliserte mesodermforløpercellene apikal innsnevring og invasitt fra overflaten av embryoet ved å danne en fremre-posteriort orientert fure^22,23. Dannelsen av ventrale furer har lenge vært brukt som en modell for å studere mekanismen for epitelfolding. Ventral furedannelse administreres av det dorsal-ventrale mønstersystemet i Drosophila^24,25,26,27. Uttrykket av to transkripsjonsfaktorer, Twist og Snail, lokalisert på ventralsiden av embryoet, styrer ventral furedannelse og spesifiserer mesodermal celleskjebne²⁸. Twist and Snail aktiverer rekrutteringen av Rho1 GEF RhoGEF2 til toppunktet av mesodermforløpercellene via en G-proteinkoblet reseptorvei og et RhoGEF2-adapterprotein, T48 29,30,31,32,33. Deretter aktiverer RhoGEF2 myosin gjennom den apikale overflaten av potensiell mesoderm gjennom Rho-Rho kinasebanen 34,35,36,37,38,39. Aktivert myosin danner et supracellulært actomyosinnettverk gjennom den apikale overflaten av mesoderm primordium, hvis sammentrekninger driver apikal innsnevring og resulterer i en rask økning i apikal vevspenning 14,37,40.

Det optogenetiske verktøyet beskrevet i denne protokollen, Opto-Rho1DN, hemmer aktomyosinkontraktilitet gjennom rekruttering av blålysavhengige plasmamembraner av en dominant negativ form for Rho1 (Rho1DN)⁴¹. En T19N-mutasjon i Rho1DN eliminerer mutantproteinets evne til å bytte BNP mot GTP og gjør dermed proteinet evig inaktivt³⁴. En påfølgende mutasjon i Rho1DN, C189Y, eliminerer dens naive membranmålrettingssignal^42,43. Når Rho1DN infunderes til plasmamembranen, binder den seg til og impounds Rho1 GEFs, og blokkerer dermed aktiveringen av Rho1 samt Rho1-mediert aktivering av myosin og aktin^34,44. Plasmamembranrekrutteringen til Rho1DN oppnås gjennom en lysavhengig dimeriseringsmodul avledet fra Cryptochrome 2 og dens bindingspartner CIB1. Cryptochrome 2 er en blålysaktivert kryptokrom fotoreseptor i Arabidopsis thaliana⁴⁵. Kryptokrom 2 binder seg til CIB1, et grunnleggende helix-loop-helix-protein, bare i sin fotoeksiterte tilstand⁴⁵. Det ble senere funnet at den konserverte N-terminale, fotolyase homologiregionen (PHR), fra Cryptochrome 2 (CRY2_PHR, heretter referert til som CRY2) og det N-terminale domenet (aa 1-170) til CIB1 (heretter CIBN) er viktige for lysindusert dimerisering⁴⁶. Opto-Rho1DN inneholder to komponenter. Den første komponenten er CIBN-proteinet smeltet sammen med et CAAX-anker, som lokaliserer proteinet til plasmamembranen⁴⁷. Den andre komponenten er mCherry-merket CRY2 smeltet sammen med Rho1DN⁴¹. I fravær av blått lys forblir CRY2-Rho1DN i cytoplasma. Ved blålysstimulering målrettes CRY2-Rho1DN mot plasmamembranen gjennom samspillet mellom membranforankret CIBN og eksitert CRY2. Opto-Rho1DN kan aktiveres av ultrafiolett A (UVA) lys og blått lys (400-500 nm, maksimal aktivering ved 450-488 nm), eller av en 830-980 nm pulserende laser når du utfører to-foton stimulering^41,46,47,48. Derfor stimuleres Opto-Rho1DN av bølgelengder som normalt brukes til spennende GFP (488 nm for enkeltfotonavbildning og 920 nm for to-foton avbildning). I motsetning til dette stimulerer bølgelengder som vanligvis brukes til spennende mCherry (561 nm for enkeltfotonavbildning og 1,040 nm for to-foton avbildning) ikke den optogenetiske modulen og kan derfor brukes til pre-stimuleringsavbildning. Protokollen beskriver tilnærmingene som brukes for å minimere risikoen for uønsket stimulering under prøvemanipulering.

Laserablasjon har vært mye brukt til å oppdage og måle spenning i celler og vev⁴⁹. Tidligere studier har vist at når laserintensiteten er riktig kontrollert, kan to-foton laserablasjon ved bruk av en femtosekund nær-infrarød laser fysisk svekke noen subcellulære strukturer (f.eks. Kortikale actomyosinnettverk) uten å forårsake plasmamembranraptur^50,51. Hvis vevet er under spenning, resulterer laserablasjon av et område av interesse i vevet i en umiddelbar utadgående rekyl av cellene ved siden av det ablerte området. Rekylhastigheten er en funksjon av størrelsen på spenningen og viskositeten til mediet (cytoplasma) som omgir strukturene som gjennomgår rekyl⁴⁹. På grunn av den overlegne penetrasjonsdybden til de nær-infrarøde lasere og evnen til å oppnå godt begrenset fokal ablasjon, er to-foton laserablasjon spesielt nyttig for å oppdage vevspenning in vivo. Som demonstrert i denne protokollen, kan denne metoden enkelt kombineres med Opto-Rho1DN-mediert inaktivering av aktomyosinkontraktilitet for å undersøke den direkte effekten av Rho1-avhengig cellulær kontraktilitet på vevsmekanikk under dynamisk vevsremodellering.

Protocol

1. Sette opp det genetiske korset og forberede egginnsamlingskoppen Velg kvinnelige fluer (jomfru) fra den optogenetiske linjen UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) på en CO2 -pute under et stereomikroskop og satt opp et kryss med mannlige fluer fra mors GAL4 driverlinje 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP.MERK: 67 og 15 står for mor-Tubulin-GAL4 satt inn i henholdsvis andre (II) og tredje (III) kromosomer, henholdsvis52. GAL4-linjen som brukes …

Representative Results

I de ustimulerte embryoene som gjennomgikk apikal innsnevring, ble Sqh-mCherry anriket i det mediaapiske området av de ventrale mesodermale cellene, mens CRY2-Rho1DN-mCherry var cytosolisk (figur 1A). Laserablasjon innenfor innsnevringsdomenet førte til rask vevsrekyl langs A-P-aksen (figur 1B,C). I de stimulerte embryoene ble CRY2-Rho1DN-mCherry-signalet plasmamembranlokalisert, mens det medioapikale signalet fra Sqh-mCherry helt forsvant (<s…

Discussion

Denne protokollen beskrev kombinert bruk av optogenetikk og laserablasjon for å undersøke endringer i vevsspenning umiddelbart etter inaktivering av aktomyosinkontraktilitet. Det optogenetiske verktøyet beskrevet her utnytter den dominerende negative formen av Rho1 (Rho1DN) til akutt å hemme endogen Rho1 og Rho1-avhengig aktomyosinkontraktilitet. Tidligere karakterisering av Opto-Rho1DN i sammenheng med Drosophila ventral furedannelse viste at verktøyet er svært effektivt for å formidle den raske inaktive…

Materials

35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation