Dette arbejde demonstrerer brugen af en multimodal ultralydsbaseret billeddannelsesplatform til ikke-invasiv billeddannelse af iskæmisk slagtilfælde. Dette system muliggør kvantificering af iltning af blodet gennem fotoakustisk billeddannelse og nedsat perfusion i hjernen gennem akustisk angiografi.
Præsenteret her er en eksperimentel iskæmisk slagtilfælde undersøgelse ved hjælp af vores nyudviklede noninvasive billeddannelsessystem, der integrerer tre akustisk baserede billeddannelsesteknologier: fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT). Kombination af disse tre modaliteter hjælper med at erhverve multispektral fotoakustisk tomografi (PAT) af hjernens blodiltning, højfrekvent ultralydsbilleddannelse af hjernevævet og akustisk angiografi af cerebral blodperfusion. Den multimodale billeddannelsesplatform gør det muligt at studere cerebral perfusion og iltningsændringer i hele musehjernen efter slagtilfælde. To almindeligt anvendte iskæmiske slagtilfælde modeller blev evalueret: den permanente midterste cerebrale arterieokklusion (pMCAO) model og den fototrombotiske (PT) model. PAUSAT blev brugt til at afbilde de samme musehjerner før og efter et slagtilfælde og kvantitativt analysere begge slagtilfældemodeller. Dette billeddannelsessystem var i stand til tydeligt at vise hjernens vaskulære ændringer efter iskæmisk slagtilfælde, herunder signifikant reduceret blodperfusion og iltning i slagtilfældeinfarktområdet (ipsilateralt) sammenlignet med det uskadte væv (kontralateralt). Resultaterne blev bekræftet af både laser speckle kontrast billeddannelse og triphenyltetrazolium chlorid (TTC) farvning. Desuden blev slaginfarktvolumen i begge slagmodeller målt og valideret ved TTC-farvning som grundsandheden. Gennem denne undersøgelse har vi vist, at PAUSAT kan være et kraftfuldt værktøj i ikke-invasive og langsgående prækliniske studier af iskæmisk slagtilfælde.
Blod transporterer ilt (via hæmoglobinproteinet) og andre vigtige næringsstoffer til væv i vores kroppe. Når blodstrømmen gennem væv afbrydes (iskæmi), kan der opstå alvorlig skade på vævene, hvis mest umiddelbare virkninger skyldes mangel på ilt (hypoxi). Iskæmisk slagtilfælde er resultatet af afbrudt blodgennemstrømning til en bestemt region af hjernen. Hjerneskaden som følge af et iskæmisk slagtilfælde kan forekomme inden for få minutter efter en karblokering og kan ofte have invaliderende og varige virkninger 1,2. En meget værdifuld strategi til at evaluere fysiopatologien efter iskæmisk slagtilfælde og identificere og teste nye behandlinger er brugen af smådyrsmodeller i laboratoriet. Behandlinger opdaget i laboratoriet sigter mod at blive oversat til klinisk brug og forbedre patienternes liv. Imidlertid skal brugen af dyr i biomedicinsk forskning evalueres nøje i henhold til Russell og Burchs 3R-principper: udskiftning, reduktion og forfining3. Formålet med reduktionskomponenten er at reducere antallet af dyr uden at gå på kompromis med dataindsamlingen. Med dette i tankerne giver det at være i stand til i længderetningen at evaluere læsionsudviklingen via ikke-invasiv billeddannelse en stor fordel ved at reducere antallet af krævede dyr samt maksimere informationen opnået fra hvert dyr4.
Fotoakustisk tomografi (PAT) er en hybrid billeddannelsesmodalitet, der kombinerer optisk absorptionskontrast med ultralydsbilleddannelserumlig opløsning 5. Billeddannelsesmekanismen for PAT er som følger. En excitationslaserpuls lyser på målet, der afbildes. Forudsat at målet absorberer lys ved excitationslaserens bølgelængde, vil det stige i temperatur. Denne hurtige temperaturstigning resulterer i en termoelastisk udvidelse af målet. Udvidelsen får en ultralydbølge til at sprede sig ud fra målet. Ved at detektere ultralydbølgen på mange positioner kan den tid, der kræves for bølgen at forplante sig fra målet til detektorerne, bruges til at skabe et billede gennem en rekonstruktionsalgoritme. PAT’s evne til at detektere optisk absorption i dybe vævsområder adskiller PAT fra ultralydsbilleddannelse, som registrerer grænser for forskellige akustiske impedanser af væv5. I de synlige og nær-infrarøde spektre er de primære stærkt absorberende biomolekyler, der er rigelige i organismer, hæmoglobin, lipider, melanin og vand7. Af særlig interesse i undersøgelsen af slagtilfælde er hæmoglobin. Da oxyhemoglobin og deoxyhemoglobin har forskellige optiske absorptionsspektre, kan PAT anvendes med flere excitationslaserbølgelængder for at bestemme den relative koncentration af proteinets to tilstande. Dette gør det muligt at kvantificere iltmætningen af hæmoglobin (sO2) eller iltning i blodet i og uden for infarktområdet 8,9. Dette er en vigtig foranstaltning i iskæmisk slagtilfælde, da det kan indikere niveauet af ilt i det beskadigede hjernevæv efter iskæmi.
Akustisk angiografi (AA) er en kontrastforstærket ultralydsbilleddannelsesmetode, der er særlig nyttig til billeddannelse af vaskulaturens morfologi in vivo10. Metoden er afhængig af brugen af en wobblertransducer med dobbelt element (et lavfrekvent element og et højfrekvent element) i forbindelse med mikrobobler injiceret i billeddannelsesemnets kredsløbssystem. Transducerens lavfrekvente element bruges til transmission ved mikroboblernes resonansfrekvens (f.eks. 2 MHz), mens højfrekvenselementet bruges til at modtage mikroboblernes superharmoniske signaler (f.eks. 26 MHz). Når de exciteres ved en resonansfrekvens, har mikroboblerne et stærkt ikke-lineært respons, hvilket resulterer i produktion af superharmoniske signaler, der omgivende kropsvæv ikke producerer11. Ved at modtage med et højfrekvent element sikrer dette, at kun mikroboblesignalerne detekteres. Da mikroboblerne er begrænset til blodkarrene, er resultatet et angiografisk billede af blodkarmorfologi. AA er en kraftfuld metode til billeddannelse af iskæmisk slagtilfælde, da mikroboblerne, der strømmer gennem kredsløbssystemet, ikke er i stand til at strømme gennem blokerede kar. Dette gør det muligt for AA at detektere områder i hjernen, der ikke er perfuserede på grund af iskæmisk slagtilfælde, hvilket indikerer infarktområdet.
Præklinisk iskæmisk slagtilfælde forskning generelt er afhængig af brugen af histologi og adfærdsmæssige test for at vurdere placeringen og sværhedsgraden af slagtilfælde. Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) farvning er en almindelig histologisk analyse, der anvendes til at bestemme slaginfarktvolumenet. Det kan dog kun bruges ved et endepunkt, da det kræver, at dyret aflives12. Adfærdstest kan bruges til at bestemme nedsat motorfunktion på flere tidspunkter, men de kan ikke give kvantitative anatomiske eller fysiologiske værdier13. Biomedicinsk billeddannelse giver en mere kvantitativ tilgang til at studere virkningerne af iskæmisk slagtilfælde ikke-invasivt og langsgående 9,14,15. Imidlertid kan eksisterende billeddannelsesteknologier (såsom magnetisk resonansbilleddannelse [MRI]) til små dyr komme til en høj pris, være ude af stand til at levere samtidig strukturel og funktionel information eller have begrænset penetrationsdybde (som de fleste optiske billeddannelsesteknikker).
Her kombinerer vi fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT; se systemdiagram i figur 1), som giver mulighed for komplementær strukturel og funktionel information om blodperfusion og iltning efter iskæmisk slagtilfælde16. Dette er to vigtige aspekter ved vurderingen af skadens alvor og overvågningen af helbredelsen eller responsen på behandlingerne. Brug af disse integrerede billeddannelsesmetoder kan øge mængden af information opnået af hvert dyr, reducere antallet af dyr, der kræves, og give mere information i undersøgelsen af potentielle behandlinger for iskæmisk slagtilfælde.
Figur 1: PAUSAT diagram . (A) Komplet skematisk oversigt over PAUSAT systemet, herunder laser og OPO, der anvendes til PAT. (B) Indvendig visning af PAUSAT systemet, herunder to ultralydstransducere. Dual-element wobblertransduceren bruges til både B-mode ultralyd og AA, og lineær array-transduceren bruges til PAT. Begge transducere er monteret på det samme 2D-motoriserede trin, hvilket gør det muligt at scanne for at generere volumetriske data. Dette tal er ændret fra16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Der er et par vitale aspekter af denne metode, der, hvis den gøres forkert, kan føre til betydeligt nedsat billedkvalitet og kvantitativ analyse. Det mest almindeligt forekommende resultat af brugerfejl i PAUSAT-billeder er enten mangel på signal eller meget lav signalstyrke, som begge kan forekomme af forskellige årsager. En sådan grund er et problem med den akustiske kobling. Store luftbobler i vandet, der omgiver musens hoved under billeddannelse, kan ofte blokere ultralydet fra at rejse til eller fra transducere…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende ingeniørteamet hos SonoVol Inc. for deres tekniske support. Dette arbejde blev delvist sponsoreret af American Heart Association Collaborative Sciences Award (18CSA34080277) til J. Yao og W. Yang; United States National Institutes of Health (NIH) yder R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (BRAIN Initiative), R01 NS111039, R01 EB028143; United States National Science Foundation (NSF) CAREER award 2144788; Chan Zuckerberg Initiative Grant (2020-226178) til J. Yao; og NIH giver R21NS127163 og R01NS099590 til W. Yang.
20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |