Frihånds intracerebroventrikulære injeksjoner hos mus
Summary
Her beskrives en enkel og rask tilnærming for å utføre intracerebroventrikulære injeksjoner hos mus ved hjelp av en frihåndstilnærming (det vil si uten en stereotaksisk enhet).
Abstract
Undersøkelsen av nevroendokrine systemer krever ofte levering av medisiner, virus eller andre eksperimentelle midler direkte inn i hjernen til mus. En intracerebroventrikulær (ICV) injeksjon tillater utbredt levering av eksperimentelt middel gjennom hele hjernen (spesielt i strukturer nær ventriklene). Her beskrives metoder for å lage frihånds ICV-injeksjoner hos voksne mus. Ved å bruke visuelle og taktile landemerker på musens hoder, kan injeksjoner i laterale ventrikler gjøres raskt og pålitelig. Injeksjonene er laget med en glasssprøyte holdt i eksperimentørens hånd og plassert på omtrentlige avstander fra landemerkene. Dermed krever denne teknikken ikke en stereotaksisk ramme. Videre krever denne teknikken bare kortvarig isoflurananestesi, noe som tillater etterfølgende vurdering av musens atferd og/eller fysiologi hos våkne, fritt oppførende mus. Frihånds ICV-injeksjon er et kraftig verktøy for effektiv levering av eksperimentelle midler i hjernen til levende mus og kan kombineres med andre teknikker som hyppig blodprøvetaking, nevralkretsmanipulasjon eller in vivo-opptak for å undersøke nevroendokrine prosesser.
Introduction
Levering av eksperimentelle midler, for eksempel narkotika1, virus2 eller celler3, til hjernen er ofte nødvendig for nevroendokrin forskning. Hvis agenten ikke lett krysser blod-hjernebarrieren eller det eksperimentelle målet er å spesifikt teste de sentrale effektene av midlet, er det viktig å ha en pålitelig metode for å levere injeksjoner i hjernen. Videre gir injeksjon i det intracerebroventrikulære (ICV) rommet muligheten til å distribuere midlet bredt i hjernen og gir et stort målområde, og øker dermed sannsynligheten for vellykket injeksjon2.
En vanlig metode for å lage ICV-injeksjoner innebærer plassering av en permanent inneliggende kanyle. I denne tilnærmingen er en stereotaksisk ramme nødvendig for å plassere den kommersielt tilgjengelige eller skreddersydde kanylen, da kanylen limes eller sementeres på plass. Ofte, ved utvinning, administreres en suprafysiologisk dose angiotensin II gjennom kanylen, og hvis drikkeadferd umiddelbart observeres, anses kanylen å være riktig plassert4. Denne tilnærmingen har mange fordeler, inkludert evnen til å utføre langvarig infusjon og evnen til å injisere det samme dyret flere ganger; I tillegg, hvis angiotensin II benyttes, kan korrekt plassering bekreftes før administrering av eksperimentelle forbindelser. Det er imidlertid noen begrensninger ved å plassere en permanent kanyle, inkludert kravet om dyrt utstyr (stereotaksisk ramme), muligheten for skade på kanylen etter plassering (f.eks. mus kan tygge på kanylen til en burkompis) og muligheten for infeksjoner rundt den permanente kanylen. Enkelte ICV-injeksjoner kan gjøres ved bruk av en stereotaksisk ramme3, som, selv om den er effektiv, krever betydelig eksponering for anestesi og dermed kan skjule noen akutte fysiologiske og atferdsmessige effekter av behandlingen. I tillegg krever plassering av mus i en stereotaksisk ramme betydelig trening for å oppnå stabil plassering og forhindre brudd på ørekanaler.
Her beskrives en etablert metode for å lage frihåndsinjeksjoner hos mus. Denne metoden er basert på tidligere rapporter 5,6. Fordelene med denne teknikken er at den er enkel, rask og ikke krever spesialutstyr som en stereotaksisk ramme. Som beskrevet nedenfor innebærer denne prosedyren å manipulere en glasssprøyte i forhold til landemerker på musehodet for å gjøre injeksjonene, noe som kan gjøres raskt og krever derfor bare noen få minutter med gassbedøvelse på eksperimentdagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrives et enkelt og effektivt middel for å lage ICV-injeksjoner hos mus. Siden denne teknikken ikke krever en stereotaksisk ramme, er denne tilnærmingen for sentral levering av narkotika og eksperimentelle midler tilgjengelig for flere forskere. I tillegg er denne tilnærmingen relativt høy gjennomstrømning siden forberedelses- og injeksjonsprosedyren kan utføres raskt.
Siden denne prosedyren krever manipulering av nåler og en glasssprøyte for hånd med omtrentlige avstander, anb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Dr. Kellie Breen Church, Michael Kreisman og Jessica Jang for deres bidrag til å samle inn dataene som vises i de representative resultatene. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (RBM).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
Riferimenti
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
