Et sæt screeningsteknikker til et hurtigt overblik over neutrofilfunktionen

Summary

Denne protokol indeholder et sæt neutrofile funktionelle assays, der skal bruges som screeningsmetode til at dække funktioner fra forskellige signalveje. Protokollen indeholder en indledende og enkel evaluering af cellelevedygtighed, renhed, produktion af reaktive iltarter, realtidsmigration, fagocytose og et foreløbigt forslag til neutrofile ekstracellulære fælder.

Abstract

Neutrofiler er kendt som en af de første forsvarslinjer i det medfødte immunrespons og kan udføre mange særlige cellulære funktioner, såsom kemotaxis, omvendt migration, fagocytose, degranulering af cytotoksiske enzymer og metabolitter og frigivelse af DNA som neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er). Neutrofiler har ikke kun stramt reguleret signalering selv, men deltager også i reguleringen af andre komponenter i immunsystemet. Da friske neutrofiler er terminalt differentierede, kortvarige og meget variable blandt individer, er det vigtigt at få mest muligt ud af de indsamlede prøver. Forskere har ofte brug for at udføre screeningsanalyser for at vurdere et overblik over de mange neutrofile funktioner, der kan påvirkes af specifikke forhold under evaluering. Et sæt tests efter en enkelt isolationsproces af neutrofiler med normal densitet blev udviklet for at imødekomme dette behov og søge en balance mellem hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed. Resultaterne kan bruges til at ræsonnere og vejlede dybdegående opfølgningsundersøgelser. Denne procedure kan udføres i en gennemsnitlig tid på 4 timer og inkluderer evaluering af cellelevedygtighed, produktion af reaktive iltarter (ROS), migration i realtid og fagocytose af gær på glasglas, hvilket efterlader nok celler til mere detaljerede tilgange som omics-undersøgelser. Desuden omfatter proceduren en måde til let at observere et foreløbigt forslag til NET’er efter hurtig panoptisk farvning observeret ved lysmikroskopi med mangel på specifikke markører, omend nok til at indikere, om yderligere bestræbelser på denne måde ville være umagen værd. Mangfoldigheden af testede funktioner kombinerer fælles punkter blandt test, hvilket reducerer analysetiden og udgifterne. Proceduren blev navngivet NeutroFun Screen, og selvom den har begrænsninger, balancerer den de førnævnte faktorer. Desuden er formålet med dette arbejde ikke et bestemt testsæt, men snarere en retningslinje, der let kan tilpasses det enkelte laboratoriums ressourcer og krav.

Introduction

Neutrofiler er de mest rigelige medfødte immunceller i humant blod og er kendt for at spille en vigtig rolle i infektion og betændelse, idet de er de første respondenter, der ankommer til stedet for vævsskade¹. I de senere år har der været en voksende anerkendelse af den afgørende rolle, som neutrofiler spiller i en række sygdomme og i at støtte homeostase². Neutrofiler har ikke kun stramt reguleret signalering selv, men deltager også i reguleringen af andre komponenter i immunsystemet ^3,4,5. Derfor er det bydende nødvendigt at undersøge neutrofiler og deres mange usædvanlige cellulære funktioner, såsom kemotaxis, omvendt migration⁶, fagocytose⁷, respiratorisk burst⁸ og frigivelse af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs)⁷, i adskillige forskningssammenhænge, hvor det er nødvendigt at vurdere de potentielle neutrofile funktionelle, morfologiske eller molekylære ændringer udløst af specifikke forhold under analyse.

Frisk isolerede neutrofiler er terminalt differentierede, kortvarige, meget dynamiske og let aktiverede⁹. Imidlertid er der endnu ikke opnået en effektiv lagringsmetode, der ikke påvirker neutrofilresponserne, hvilket gør det udfordrende at udføre flere assays, der skal være uafbrudte. Desuden er tidligere beskrevne funktionelle analyser ^10,11, baseret på assays, der kræver cytometri og / eller fluorescerende farvning, muligvis ikke et levedygtigt valg, når en bred og indledende evaluering af neutrofilen er nødvendig.

For at løse disse problemer beskriver denne protokol et sæt tests, der kan udføres efter en enkelt isolationsproces, herunder evaluering af cellelevedygtighed, produktion af reaktive iltarter (ROS), migration i realtid og fagocytose af Saccharomyces cerevisiae, hvis resultater kan bruges til at begrunde dybdegående opfølgningsundersøgelser. Denne procedure, kaldet NeutroFun Screen, blev designet til at omfatte de førende effektoraktiviteter, undtagen degranulering, og kan afsluttes i en gennemsnitlig tid på 4 timer, inklusive 1 times aktivering. Derudover kan de resterende celler bruges til mere detaljerede tilgange som omics-undersøgelser. Fordelen ved denne metode ligger i dens balance mellem hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed.

Desuden er der en måde, hvorpå man let kan observere et foreløbigt forslag om NET’er uden specifikke markører, men nok til at indikere, om yderligere bestræbelser i den retning ville være umagen værd. Mangfoldigheden af testede funktioner sigter mod at kombinere fælles punkter blandt test, hvilket reducerer analysetiden og omkostningerne. Hovedformålet med denne metode er at give en afbalanceret, funktionel analyse vedrørende hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed, der giver mulighed for et overblik over neutrofilens respons, hvilket gør det til et nyttigt indledende skridt i undersøgelsen af virkningerne af nye stimuli på neutrofiler med normal densitet.

Protocol

Alle eksperimenter fulgte nøje de etiske retningslinjer, der blev fastsat af det institutionelle gennemgangsudvalg ved University of Brasilia (proces 13364819.0.0000.5558), og prøver blev identificeret med koder for at sikre donoranonymitet. Cellerne blev opnået fra normale raske mandlige donorer i alderen 18-35 år, som underskrev det informerede samtykke og opfyldte følgende kvalifikationskriterier: ikke-rygere / dampere, ingen kroniske helbredstilstande og ingen historie med inflammatoriske tilstande i de sidste 1…

Representative Results

Den tæthedsbaserede isolationsmetode, der blev anvendt i denne undersøgelse (figur 1), opfyldte kriterierne for de foreslåede eksperimenter. Neutrofile parametre opnået fra denne metode omfattede levedygtighed ≥98%, renhed ≥94% og celleudbytte ≥1,5 x 107, uden aktivering detekterbar ved screeningstestene. To relevante trin i isoleringen af PMN’er er antikoagulation og fjernelse af RBC. At holde det antikoagulerede blodrør eller sprøjte ved en blid rocking, før lagdeli…

Discussion

Neutrofiler er meget dynamiske og lydhøre celler, der er kortvarige og endnu ikke kan kryopræserveres¹⁹, hvilket gør undersøgelser af deres biologi udfordrende. Derfor er det vigtigt at følge omhyggelige trin for at opnå levedygtige, berigede og hvilende neutrofiler ^11,20. Denne undersøgelse anvendte en tæthedsbaseret isolationsteknik, der understreger blid og minimal manipulation samt brugen af lave temperaturer indtil aktiverings…

Materials

CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma – Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma – Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma – Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma – Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma – Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma – Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma – Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma – Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software