Un ensemble de techniques de dépistage pour un aperçu rapide de la fonction des neutrophiles

Summary

Ce protocole comprend un ensemble de tests fonctionnels des neutrophiles à utiliser comme méthode de criblage pour couvrir les fonctions de différentes voies de signalisation. Le protocole comprend une évaluation initiale et simple de la viabilité cellulaire, de la pureté, de la production d’espèces réactives de l’oxygène, de la migration en temps réel, de la phagocytose et d’une suggestion préliminaire de pièges extracellulaires à neutrophiles.

Abstract

Les neutrophiles sont connus comme l’une des premières lignes de défense de la réponse immunitaire innée et peuvent remplir de nombreuses fonctions cellulaires particulières, telles que la chimiotaxie, la migration inverse, la phagocytose, la dégranulation des enzymes et des métabolites cytotoxiques et la libération d’ADN sous forme de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Les neutrophiles ont non seulement une signalisation étroitement régulée, mais participent également à la régulation d’autres composants du système immunitaire. Comme les neutrophiles frais sont différenciés en phase terminale, de courte durée de vie et très variables d’un individu à l’autre, il est important de tirer le meilleur parti des échantillons collectés. Les chercheurs doivent souvent effectuer des tests de dépistage pour avoir une vue d’ensemble des nombreuses fonctions des neutrophiles qui peuvent être affectées par des conditions spécifiques en cours d’évaluation. Une série de tests suivant un seul processus d’isolement de neutrophiles de densité normale a été développée pour répondre à ce besoin, en recherchant un équilibre entre la rapidité, l’exhaustivité, le coût et la précision. Les résultats peuvent être utilisés pour raisonner et guider des études de suivi approfondies. Cette procédure peut être réalisée dans un temps moyen de 4 h et comprend l’évaluation de la viabilité cellulaire, de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), de la migration en temps réel et de la phagocytose de la levure sur des lames de verre, laissant suffisamment de cellules pour des approches plus détaillées telles que les études omiques. De plus, la procédure comprend un moyen d’observer facilement une suggestion préliminaire de TNE après une coloration panoptique rapide observée par microscopie optique, avec un manque de marqueurs spécifiques, mais suffisamment pour indiquer si des efforts supplémentaires dans ce sens en vaudraient la peine. La diversité des fonctions testées combine des points communs entre les tests, réduisant ainsi le temps et les coûts d’analyse. La procédure a été nommée NeutroFun Screen, et bien qu’elle ait des limites, elle équilibre les facteurs susmentionnés. De plus, l’objectif de ce travail n’est pas d’établir un ensemble de tests défini, mais plutôt une ligne directrice qui peut être facilement adaptée aux ressources et aux exigences de chaque laboratoire.

Introduction

Les neutrophiles sont les cellules immunitaires innées les plus abondantes dans le sang humain et sont connues pour jouer un rôle majeur dans l’infection et l’inflammation, étant les premiers intervenants à arriver sur le site des lésions tissulaires¹. Ces dernières années, il y a eu une reconnaissance croissante du rôle crucial que jouent les neutrophiles dans une variété de maladies et dans le soutien de l’homéostasie². Les neutrophiles ont non seulement une signalisation étroitement régulée, mais participent également à la régulation d’autres composants du système immunitaire ^3,4,5. Par conséquent, l’étude des neutrophiles et de leurs nombreuses fonctions cellulaires inhabituelles, telles que la chimiotaxie, la migration inverse⁶, la phagocytose⁷, l’explosion respiratoire⁸ et la libération de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE)⁷, est impérative dans de nombreux contextes de recherche où il est nécessaire d’évaluer les changements fonctionnels, morphologiques ou moléculaires potentiels des neutrophiles déclenchés par des conditions spécifiques en cours d’analyse.

Les neutrophiles fraîchement isolés sont différenciés en phase terminale, de courte durée, très dynamiques et facilement activés⁹. Cependant, une méthode de stockage efficace qui n’affecte pas les réponses des neutrophiles n’a pas encore été mise au point, ce qui rend difficile la réalisation de plusieurs tests qui doivent être ininterrompus. De plus, les analyses fonctionnelles décrites précédemment^10,11, basées sur des tests qui nécessitent une cytométrie et/ou une coloration fluorescente, peuvent ne pas être un choix viable lorsqu’une évaluation large et initiale du neutrophile est nécessaire.

Pour répondre à ces questions, ce protocole décrit un ensemble de tests qui peuvent être effectués à la suite d’un seul processus d’isolement, y compris l’évaluation de la viabilité cellulaire, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), la migration en temps réel et la phagocytose de Saccharomyces cerevisiae, dont les résultats peuvent être utilisés pour raisonner des études de suivi approfondies. Cette procédure, baptisée NeutroFun Screen, a été conçue pour englober les principales activités effectrices, à l’exception de la dégranulation, et peut être réalisée en un temps moyen de 4 h, dont 1 h d’activation. De plus, les cellules restantes peuvent être utilisées pour des approches plus détaillées telles que des études omiques. L’avantage de cette méthode réside dans son équilibre entre la rapidité, l’exhaustivité, le coût et la précision.

De plus, il existe un moyen d’observer facilement une suggestion préliminaire de TNE, sans marqueurs spécifiques, mais suffisamment pour indiquer si des efforts supplémentaires dans cette direction en vaudraient la peine. La diversité des fonctions testées vise à combiner les points communs entre les tests, réduisant ainsi le temps et les coûts d’analyse. L’objectif principal de cette méthode est de fournir une analyse fonctionnelle équilibrée en ce qui concerne la vitesse, l’exhaustivité, le coût et la précision qui permet d’avoir une vue d’ensemble de la réponse du neutrophile, ce qui en fait une première étape utile dans l’étude des effets de nouveaux stimuli sur les neutrophiles de densité normale.

Protocol

Toutes les expériences ont strictement suivi les directives éthiques établies par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Brasilia (processus 13364819.0.0000.5558), et les échantillons ont été identifiés par des codes pour garantir l’anonymat des donneurs. Les cellules ont été obtenues auprès de donneurs masculins normaux en bonne santé âgés de 18 à 35 ans, qui ont signé le consentement éclairé et répondaient aux critères d’admissibilité suivants : non-fumeurs/vapoteurs, aucun p…

Representative Results

La méthode d’isolement basée sur la densité utilisée dans cette étude (figure 1) répondait aux critères des expériences proposées. Les paramètres des neutrophiles obtenus par cette méthode comprenaient la viabilité ≥98 %, la pureté ≥94 %) et le rendement cellulaire ≥1,5 x 107, sans activation détectable par les tests de dépistage. Deux étapes pertinentes dans l’isolement des NMP sont l’anticoagulation et l’élimination des globules rouges. Le fait de …

Discussion

Les neutrophiles sont des cellules très dynamiques et réactives qui ont une courte durée de vie et ne peuvent pas encore être cryoconservées¹⁹, ce qui rend difficile l’étude de leur biologie. Par conséquent, il est essentiel de suivre des étapes minutieuses pour obtenir des neutrophiles viables, enrichis et au repos^11,20. Cette étude a utilisé une technique d’isolement basée sur la densité qui met l’accent sur une manipul…

Materials

CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma – Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma – Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma – Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma – Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma – Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma – Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma – Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma – Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software