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Immunologia e infezioni

好中球機能の概要を把握するための一連のスクリーニング技術

Published: February 09, 2024
doi:
10.3791/65329
, , , , , ,
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology,University of Brasilia, 2Institute of Physics,University of Brasilia

Summary

このプロトコルは異なったシグナリング細道からの機能をカバーするスクリーニング方法として使用されるべき一組の好中球の機能試金を特色にする。プロトコルは好中球の細胞外トラップの細胞生存率、純度、活性酸素種の生産、実時間移動、食作用および予備の提案の初期および簡単な評価を含んでいる。

Abstract

好中球は、自然免疫応答における防御の最前線の1つとして知られており、走化性、逆遊走、食作用、細胞傷害性酵素および代謝産物の脱顆粒、好中球細胞外トラップ(NET)としてのDNAの放出など、多くの特定の細胞機能を実行することができます。好中球は、それ自体が厳密に制御されたシグナル伝達を持っているだけでなく、免疫系の他の構成要素の制御にも関与しています。新鮮な好中球は末期分化型で、寿命が短く、個人差が大きいため、採取したサンプルを最大限に活用することが重要です。研究者は、評価中の特定の条件によって影響を受ける可能性のある多くの好中球機能の概要を評価するために、スクリーニングアッセイを実施する必要があることがよくあります。このニーズに対応するために、正常密度好中球の単一の単離プロセスに続く一連のテストが開発され、速度、包括性、コスト、および精度のバランスが模索されました。この結果は、詳細な追跡調査の推論と指針として使用できます。この手順は平均4時間で実施でき、スライドガラス上での細胞生存率、活性酸素種(ROS)産生、リアルタイム移動、酵母の食作用の評価が含まれ、オミクス研究などのより詳細なアプローチに十分な細胞を残します。さらに、この手順には、光学顕微鏡で観察された高速パノプティック染色後のNETの予備的な提案を簡単に観察する方法が含まれていますが、特定のマーカーはありませんが、その方法でさらに努力する価値があるかどうかを示すのに十分です。テストする機能の多様性は、テスト間の共通点を組み合わせ、分析時間とコストを削減します。この手順はNeutroFun Screenと名付けられ、制限はありますが、前述の要素のバランスが取れています。さらに、この作業の目的は、明確なテストセットではなく、各ラボのリソースと要求に合わせて簡単に調整できるガイドラインです。

Introduction

好中球は、ヒトの血液中に最も多く存在する自然免疫細胞であり、感染や炎症に大きな役割を果たすことが知られており、組織損傷部位に最初に到達する応答者です1。近年、好中球がさまざまな疾患において、また恒常性維持(ホメオスタシス)を支える重要な役割を担っているという認識が高まっています2。好中球は、それ自体が厳密に制御されたシグナル伝達を持っているだけでなく、免疫系の他の構成要素の調節にも関与しています3,4,5。したがって、好中球と、走化性、逆遊走6、食作用7、呼吸バースト8、好中球細胞外トラップ(NET)7の放出など、好中球とその多くの異常な細胞機能を調べることは、分析中の特定の条件によって引き起こされる潜在的な好中球の機能的、形態学的、または分子的変化を評価する必要がある多くの研究状況で不可欠です。

単離されたばかりの好中球は、末端分化型で、寿命が短く、動的で、活性化しやすい9。しかし、好中球の応答に影響を与えない効率的な保存法はまだ達成されておらず、中断のない複数のアッセイを行うことは困難です。さらに、サイトメトリーおよび/または蛍光染色を必要とするアッセイに基づく、以前に記載された機能解析10,11は、好中球の広範かつ初期評価が必要な場合には実行可能な選択肢ではないかもしれない。

これらの問題に対処するために、このプロトコルでは、細胞生存率、活性酸素種(ROS)産生、リアルタイム移動、 出芽酵母の食作用の評価など、単一の分離プロセスに続いて実施できる一連のテストを記述しており、その結果を使用して詳細なフォローアップ研究を推論することができます。NeutroFun Screenと名付けられたこの手順は、脱顆粒を除く主要なエフェクター活動を網羅するように設計されており、1時間の活性化を含む平均4時間で完了することができます。さらに、残りの細胞は、オミクス研究などのより詳細なアプローチに使用できます。この方法の利点は、速度、包括性、コスト、および精度のバランスにあります。

さらに、NETの予備的な提案を、特定のマーカーなしで簡単に観察する方法がありますが、その方向でのさらなる努力が価値があるかどうかを示すのに十分です。テストされる機能の多様性は、テスト間の共通点を組み合わせることを目的としており、分析時間とコストを削減します。この方法の主な目的は、好中球の応答の概要を可能にする速度、包括性、コスト、および精度に関するバランスの取れた機能分析を提供することであり、正常密度好中球に対する新しい刺激の影響を調査する際の有用な最初のステップになります。

Protocol

すべての実験は、ブラジリア大学の治験審査委員会(プロセス13364819.0.0000.5558)によって設定された倫理ガイドラインに厳密に従い、サンプルはドナーの匿名性を確保するためのコードによって識別されました。細胞は、インフォームドコンセントに署名し、次の適格基準を満たした18〜35歳の正常な健康な男性ドナーから取得されました:非喫煙者/ベイパー、慢性的な健康状態なし、および過去…

Representative Results

この研究で使用した密度ベースの分離法(図1)は、提案された実験の基準を満たしていました。この方法から得られた好中球パラメータには、生存率≥98%、純度≥94%、および細胞収量≥1.5 x 107が含まれていましたが、スクリーニングテストでは検出可能な活性化はありませんでした。PMNの単離における2つの関連するステップは、抗凝固療法と赤血球除去です。抗?…

Discussion

好中球は非常に動的で応答性の高い細胞であり、寿命が短く、まだ凍結保存できないため19、その生物学の調査は困難です。したがって、生存可能で濃縮された安静中の好中球を得るためには、慎重な手順に従うことが不可欠です11,20。この研究では、穏やかで最小限の操作と、活性化ステップまでの低温の使用に重点を置いた密?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、FAPDF、CNPq、CAPES、UnB、FINEP、およびFINATECの助成機関に謝意を表します。

Materials

CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma – Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma – Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma – Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma – Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma – Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma – Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma – Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma – Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software
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Keywords: Neutrophil FunctionScreening TechniquesNeutroFun Screen ProtocolFunctional AssaysInnate Immune ResponsePhagocytosisChemotaxisDegranulationNET ReleaseCost-effectiveComprehensive Analysis
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Citazione di questo articolo
Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).
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