न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन के त्वरित अवलोकन के लिए स्क्रीनिंग तकनीकों का एक सेट
Summary
इस प्रोटोकॉल में विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों से कार्यों को कवर करने के लिए स्क्रीनिंग विधि के रूप में उपयोग किए जाने वाले न्यूट्रोफिल कार्यात्मक परख का एक सेट है। प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता, शुद्धता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, वास्तविक समय प्रवास, फागोसाइटोसिस, और न्यूट्रोफिल बाह्य जाल का एक प्रारंभिक सुझाव का एक प्रारंभिक और सरल मूल्यांकन भी शामिल है.
Abstract
न्यूट्रोफिल को जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में रक्षा की पहली पंक्तियों में से एक के रूप में जाना जाता है और कई विशेष सेलुलर कार्यों को कर सकता है, जैसे कि केमोटैक्सिस, रिवर्स माइग्रेशन, फागोसाइटोसिस, साइटोटॉक्सिक एंजाइम और मेटाबोलाइट्स का क्षरण, और न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (एनईटीएस) के रूप में डीएनए की रिहाई। न्यूट्रोफिल ने न केवल खुद को कसकर विनियमित किया है, बल्कि प्रतिरक्षा प्रणाली के अन्य घटकों के नियमन में भी भाग लेते हैं। चूंकि ताजा न्यूट्रोफिल व्यक्तियों के बीच टर्मिनल रूप से विभेदित, अल्पकालिक और अत्यधिक परिवर्तनशील होते हैं, इसलिए एकत्रित नमूनों का अधिकतम लाभ उठाना महत्वपूर्ण है। शोधकर्ताओं को अक्सर कई न्यूट्रोफिल कार्यों के अवलोकन का आकलन करने के लिए स्क्रीनिंग परख करने की आवश्यकता होती है जो मूल्यांकन के तहत विशिष्ट स्थितियों से प्रभावित हो सकते हैं। सामान्य घनत्व न्यूट्रोफिल की एकल अलगाव प्रक्रिया के बाद परीक्षणों का एक सेट इस आवश्यकता को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया था, गति, व्यापकता, लागत और सटीकता के बीच संतुलन की मांग करना। परिणामों का उपयोग गहन अनुवर्ती अध्ययनों के कारण और मार्गदर्शन के लिए किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को 4 घंटे के औसत समय में किया जा सकता है और इसमें सेल व्यवहार्यता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन, वास्तविक समय प्रवास, और ग्लास स्लाइड पर खमीर के फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन शामिल है, जिससे ओमिक्स अध्ययन जैसे अधिक विस्तृत दृष्टिकोणों के लिए पर्याप्त कोशिकाएं निकलती हैं। इसके अलावा, प्रक्रिया में विशिष्ट मार्करों की कमी के साथ, प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे गए तेज पैनोप्टिक धुंधला होने के बाद एनईटीएस के प्रारंभिक सुझाव का आसानी से निरीक्षण करने का एक तरीका शामिल है, हालांकि यह इंगित करने के लिए पर्याप्त है कि इस तरह से आगे के प्रयास सार्थक होंगे या नहीं। परीक्षण किए गए कार्यों की विविधता परीक्षणों के बीच सामान्य बिंदुओं को जोड़ती है, विश्लेषण समय और व्यय को कम करती है। प्रक्रिया को NeutroFun Screen नाम दिया गया था, और हालांकि सीमाएं होने के बावजूद, यह उपरोक्त कारकों को संतुलित करती है। इसके अलावा, इस काम का उद्देश्य एक निश्चित परीक्षण सेट नहीं है, बल्कि एक दिशानिर्देश है जिसे आसानी से प्रत्येक प्रयोगशाला के संसाधनों और मांगों के लिए समायोजित किया जा सकता है।
Introduction
न्यूट्रोफिल मानव रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं और संक्रमण और सूजन में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए जाने जाते हैं,ऊतक क्षति 1 की साइट पर पहुंचने वाले पहले उत्तरदाता हैं। हाल के वर्षों में, महत्वपूर्ण भूमिका की बढ़ती मान्यता रही है कि न्यूट्रोफिल विभिन्न प्रकार की बीमारियों में खेलते हैं और होमियोस्टेसिस2 का समर्थन करते हैं। न्यूट्रोफिल ने न केवल खुद को कसकर विनियमित किया है, बल्कि प्रतिरक्षा प्रणाली 3,4,5 के अन्य घटकों के नियमन में भी भाग लेते हैं। इसलिए, न्यूट्रोफिल और उनके कई असामान्य सेलुलर फ़ंक्शंस, जैसे कि केमोटैक्सिस, रिवर्स माइग्रेशन6, फागोसाइटोसिस7, श्वसन फट8, और न्यूट्रोफिल बाह्य कोशिकीय जाल (एनईटीएस)7की रिहाई की जांच करना, कई शोध संदर्भों में अनिवार्य है जहां विश्लेषण के तहत विशिष्ट परिस्थितियों द्वारा ट्रिगर किए गए संभावित न्यूट्रोफिल कार्यात्मक, रूपात्मक या आणविक परिवर्तनों का आकलन करना आवश्यक है।
हौसले से पृथक न्यूट्रोफिल टर्मिनल विभेदित, अल्पकालिक, अत्यधिक गतिशील और आसानी सेसक्रिय 9 होते हैं। हालांकि, एक कुशल भंडारण विधि जो न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं को प्रभावित नहीं करती है, अभी तक हासिल नहीं की गई है, जिससे कई परख करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है जो निर्बाध होना चाहिए। इसके अलावा, पहले वर्णित कार्यात्मक विश्लेषण10,11, साइटोमेट्री और / या फ्लोरोसेंट धुंधला की आवश्यकता होती है कि assays के आधार पर, एक व्यवहार्य विकल्प नहीं हो सकता है जब न्यूट्रोफिल का एक व्यापक और प्रारंभिक मूल्यांकन की जरूरत है.
इन मुद्दों को हल करने के लिए, यह प्रोटोकॉल परीक्षणों के एक सेट का वर्णन करता है जिसे एकल अलगाव प्रक्रिया के बाद किया जा सकता है, जिसमें सेल व्यवहार्यता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन, वास्तविक समय प्रवास, और सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया के फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन शामिल है, जिनके परिणाम गहराई से अनुवर्ती अध्ययनों का कारण बन सकते हैं। न्यूट्रोफन स्क्रीन नाम की इस प्रक्रिया को डिग्रेनुलेशन को छोड़कर, प्रमुख प्रभावक गतिविधियों को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, और इसे सक्रियण के 1 घंटे सहित 4 घंटे के औसत समय में पूरा किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, शेष कोशिकाओं का उपयोग ओमिक्स अध्ययन जैसे अधिक विस्तृत दृष्टिकोणों के लिए किया जा सकता है। इस पद्धति का लाभ गति, व्यापकता, लागत और सटीकता के बीच इसके संतुलन में निहित है।
इसके अलावा, विशिष्ट मार्करों के बिना, एनईटीएस के प्रारंभिक सुझाव को आसानी से देखने का एक तरीका है, लेकिन यह इंगित करने के लिए पर्याप्त है कि क्या उस दिशा में आगे के प्रयास सार्थक होंगे। परीक्षण किए गए कार्यों की विविधता का उद्देश्य परीक्षणों के बीच सामान्य बिंदुओं को संयोजित करना, विश्लेषण समय और व्यय को कम करना है। इस विधि का मुख्य लक्ष्य गति, व्यापकता, लागत और सटीकता के बारे में एक संतुलित, कार्यात्मक विश्लेषण प्रदान करना है जो न्यूट्रोफिल की प्रतिक्रिया के अवलोकन की अनुमति देता है, जिससे यह सामान्य घनत्व न्यूट्रोफिल पर उपन्यास उत्तेजनाओं के प्रभावों की जांच करने में एक उपयोगी प्रारंभिक कदम बन जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूट्रोफिल अत्यधिक गतिशील और उत्तरदायी कोशिकाएं हैं जो अल्पकालिक हैं और अभी तक क्रायोप्रिजर्वनहीं हो सकती हैं, जिससे उनके जीव विज्ञान में जांच चुनौतीपूर्ण हो जाती है। इसलिए, व्यवहार्य, सम?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक निम्नलिखित फंडिंग एजेंसियों को स्वीकार करते हैं: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP, और FINATEC।
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
Riferimenti
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
- Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
- Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
- Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
- El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
- Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
- Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
- Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
- Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
- Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
- Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
- Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
- Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
- Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
- Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
- Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
- Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
- Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
- Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
- Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
- Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
- Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
- Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
- Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
- Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
- Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
- Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
- Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
- Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
- Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
- Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
- Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
- Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
- Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
- Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).
