एकल-सेल सामग्री गुणों के निर्धारण के लिए कतरनी परख प्रोटोकॉल
Summary
यह प्रोटोकॉल विट्रो में कैंसर और गैर-कैंसर सेल लाइनों के यांत्रिक गुणों की मात्रा का निर्धारण करता है। कैंसर और सामान्य कोशिकाओं के यांत्रिकी में संरक्षित अंतर एक बायोमार्कर के रूप में कार्य कर सकते हैं जो रोग का निदान और निदान में निहितार्थ हो सकते हैं।
Abstract
अनियमित बायोमैकेनिक्स व्यापक अध्ययन के अधीन कैंसर जीव विज्ञान की एक पहचान हैं। एक सेल के यांत्रिक गुण एक सामग्री के समान होते हैं। तनाव और तनाव के लिए एक सेल का प्रतिरोध, इसका विश्राम समय, और इसकी लोच सभी गुण हैं जिन्हें प्राप्त किया जा सकता है और अन्य प्रकार की कोशिकाओं से तुलना की जा सकती है। कैंसर (घातक) बनाम सामान्य (गैर-घातक) कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने से शोधकर्ताओं को इस बीमारी के बायोफिज़िकल मूल सिद्धांतों को और उजागर करने की अनुमति मिलती है। जबकि कैंसर कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को सामान्य कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों से लगातार भिन्न होने के लिए जाना जाता है, संस्कृति में कोशिकाओं से इन गुणों को कम करने के लिए एक मानक प्रयोगात्मक प्रक्रिया की कमी है।
यह पेपर एक द्रव कतरनी परख का उपयोग करके विट्रो में एकल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने के लिए एक प्रक्रिया को रेखांकित करता है। इस परख के पीछे के सिद्धांत में एक एकल कोशिका पर द्रव कतरनी तनाव लागू करना और समय के साथ परिणामस्वरूप सेलुलर विरूपण की ऑप्टिकल निगरानी करना शामिल है। सेल मैकेनिकल गुणों को बाद में डिजिटल छवि सहसंबंध (डीआईसी) विश्लेषण का उपयोग करके और डीआईसी विश्लेषण से उत्पन्न प्रयोगात्मक डेटा के लिए एक उपयुक्त विस्कोस्टिक मॉडल फिट करने की विशेषता है। कुल मिलाकर, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैंसर के निदान के लिए अधिक प्रभावी और लक्षित विधि प्रदान करना है।
Introduction
कैंसर और गैर-कैंसर कोशिकाओं के बीच बायोफिज़िकल अंतर का अध्ययन करने से नए नैदानिक और चिकित्सीय अवसर1 की अनुमति मिलती है। मेकेनोबायोलॉजी में अंतर ट्यूमर की प्रगति और उपचार प्रतिरोध में कैसे योगदान देता है, यह समझना लक्षित चिकित्सा और प्रारंभिक निदानके लिए नए रास्ते प्रकट करेगा।
जबकि यह ज्ञात है कि कैंसर सेल यांत्रिक गुण सामान्य कोशिकाओं से भिन्न होते हैं (उदाहरण के लिए, प्लाज्मा झिल्ली और परमाणु लिफाफे की विस्कोस्टिकिटी) 3,4,5, जीवित कोशिकाओं में इन गुणों को मापने के लिए मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकोंकी कमी है। कतरनी परख विधि का उपयोग एकल कोशिकाओं को द्रव कतरनी तनाव के अधीन करके और लागू तनाव 3,4,5,7,8,9 के लिए उनकी व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं और प्रतिरोध का विश्लेषण करके कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यद्यपि एकल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने के लिए कई तरीकों और तकनीकों का उपयोग किया गया है, ये कोशिका सामग्री गुणों को प्रभावित करते हैं i) इंडेंटेशन गहराई, जटिल टिप ज्यामिति, या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) 10,11 से जुड़े सब्सट्रेट कठोरता के कारण कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचाना/ 13, या iii) माइक्रोपिपेट एस्पिरेशन14,15 से जुड़े जटिल तनाव अवस्थाओं को प्रेरित करना। ये बाहरी प्रभाव सेल विस्कोस्टिकिटी माप 6,16,17 की सटीकता में महत्वपूर्ण अनिश्चितताओं से जुड़े हैं।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, यहां वर्णित कतरनी परख विधि प्रक्रिया में सेलुलर सामग्री गुणों को प्रभावित किए बिना शरीर में शारीरिक प्रवाह का अनुकरण करने के लिए एक अत्यधिक नियंत्रणीय और सरल दृष्टिकोण प्रदान करती है। इस परख में द्रव कतरनी तनाव शरीर में कोशिकाओं द्वारा अनुभव किए गए यांत्रिक तनाव का प्रतिनिधित्व करते हैं या तो ट्यूमर इंटरस्टिटियम के भीतर तरल पदार्थ द्वारा या परिसंचरण के दौरान रक्त में18,19,20। इसके अलावा, ये द्रव तनाव कैंसर कोशिकाओं में विभिन्न घातक व्यवहारों को बढ़ावा देते हैं, जिसमें प्रगति, प्रवासन, मेटास्टेसिस और कोशिका मृत्यु19,21,22,23 शामिल हैं जो ट्यूमरोजेनिक और गैर-ट्यूमरोजेनिक कोशिकाओं के बीच भिन्न होते हैं। इसके अलावा, कैंसर कोशिकाओं की परिवर्तित यांत्रिक विशेषताएं (यानी, वे अक्सर एक ही अंग के भीतर पाई जाने वाली सामान्य कोशिकाओं की तुलना में “नरम” होती हैं) उन्हें शत्रुतापूर्ण ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में बने रहने, आसपास के सामान्य ऊतकों पर आक्रमण करने और दूर के स्थानों 24,25,26 पर मेटास्टेसाइज करने की अनुमति देती हैं। एक छद्म-जैविक वातावरण बनाकर जहां कोशिकाएं द्रव कतरनी तनाव के शारीरिक स्तर का अनुभव करती हैं, एक प्रक्रिया जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक है और कोशिका के लिए विनाशकारी नहीं है, प्राप्त की जाती है। इन लागू द्रव कतरनी तनावों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाएं हमें सेल यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने की अनुमति देती हैं।
यह पेपर लागू कतरनी तनाव के तहत कैंसर और गैर-कैंसर कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों और व्यवहार के व्यापक अध्ययन के लिए एक कतरनी परख प्रोटोकॉल प्रदान करता है। कोशिकाएं एक लोचदार और चिपचिपा तरीके से बाहरी बलों का जवाब देती हैं और इसलिए इसे एक विस्कोस्टिक सामग्री के रूप में आदर्श ीकृत किया जा सकताहै। इस तकनीक को वर्गीकृत किया गया है: (i) छितरी हुई एकल कोशिकाओं की कोशिका संस्कृति, (ii) द्रव कतरनी तनाव का नियंत्रित अनुप्रयोग, (iii) सीटू इमेजिंग और सेलुलर व्यवहार का अवलोकन (तनाव और विरूपण के प्रतिरोध सहित), (iv) विरूपण की सीमा निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं का तनाव विश्लेषण, और (v) एकल कोशिकाओं के विस्कोस्टिक गुणों का लक्षण वर्णन। इन यांत्रिक गुणों और व्यवहारों से पूछताछ करके, जटिल सेलुलर मेकेनोबायोलॉजी को मात्रात्मक डेटा के लिए आसुत किया जा सकता है। इस विधि को रेखांकित करने वाला एक प्रोटोकॉल विभिन्न घातक और गैर-घातक सेल प्रकारों के बीच कैटलॉगिंग और तुलना की अनुमति देता है। इन अंतरों को निर्धारित करने से नैदानिक और चिकित्सीय बायोमाकर्स स्थापित करने की क्षमता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कतरनी परख विधि, जिसमें आसपास के यांत्रिक माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ कोशिकाओं की बातचीत और यांत्रिक तनाव के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं को अनुकरण करने के लिए एक छद्म-मेकेनोबायोलॉजिकल वातावरण स्थापित कर…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक वॉर्सेस्टर पॉलिटेक्निक इंस्टीट्यूट में सोबोएजो समूह के पिछले शोधकर्ताओं को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने पहली बार इस तकनीक का नेतृत्व किया: डॉ यिफांग काओ, जिंगजी हू, और वैनेसा उज़ोनवाने। इस काम को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (एनआईएच / एनसीआई के 22 CA258410 एमडी) द्वारा समर्थित किया गया था। आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
Riferimenti
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of cancer cells. Cells. 10 (4), 887 (2021).
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. Laser-induced heating in optical traps. Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
