Ritenzione molecolare universale con microscopia ad espansione 11 volte
Summary
Presentata qui è una nuova versione della microscopia ad espansione (ExM), Magnify, che viene modificata per un’espansione fino a 11 volte, conservando una gamma completa di classi di biomolecole ed è compatibile con una vasta gamma di tipi di tessuto. Consente l’interrogazione della configurazione su scala nanometrica delle biomolecole utilizzando microscopi convenzionali limitati alla diffrazione.
Abstract
L’imaging su scala nanometrica di campioni biologici può migliorare la comprensione della patogenesi della malattia. Negli ultimi anni, la microscopia ad espansione (ExM) ha dimostrato di essere un’alternativa efficace e a basso costo alla microscopia ottica a super-risoluzione. Tuttavia, è stato limitato dalla necessità di agenti di ancoraggio specifici e spesso personalizzati per mantenere diverse classi di biomolecole all’interno del gel e dalle difficoltà nell’espandere i formati di campioni clinici standard, come il tessuto incorporato in paraffina fissato in formalina, specialmente se si desiderano fattori di espansione più grandi o epitopi proteici conservati. Qui descriviamo Magnify, un nuovo metodo ExM per un’espansione robusta fino a 11 volte in una vasta gamma di tipi di tessuto. Utilizzando la metacroleina come ancoraggio chimico tra il tessuto e il gel, Magnify trattiene più biomolecole, come proteine, lipidi e acidi nucleici, all’interno del gel, consentendo così l’imaging su larga scala dei tessuti sui microscopi ottici convenzionali. Questo protocollo descrive le migliori pratiche per garantire un’espansione dei tessuti robusta e priva di crepe, nonché suggerimenti per la manipolazione e l’imaging di gel altamente espansi.
Introduction
I sistemi biologici mostrano eterogeneità strutturale, dagli arti e dagli organi fino ai livelli di proteine su scala nanometrica. Pertanto, una comprensione completa del funzionamento di questi sistemi richiede un esame visivo su queste scale dimensionali. Tuttavia, il limite di diffrazione della luce causa difficoltà nella visualizzazione di strutture più piccole di ~ 200-300 nm su un microscopio a fluorescenza convenzionale. Inoltre, i metodi ottici di super-risoluzione 1,2,3, come la deplezione di emissione stimolata (STED), la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM), la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) e la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), sebbene potenti, presentano le loro sfide, poiché richiedono hardware e reagenti costosi e spesso hanno tempi di acquisizione lenti e una scarsa capacità di visualizzare grandi volumi in 3D.
La microscopia ad espansione4 (ExM) fornisce un mezzo alternativo per aggirare il limite di diffrazione della luce ancorando covalentemente le biomolecole in un gel polimerico gonfiabile d’acqua e separandole fisicamente, rendendole così risolvibili sui microscopi ottici convenzionali. Una moltitudine di varianti del protocollo ExM sono state sviluppate dalla pubblicazione originale di ExM meno di un decennio fa, e questi protocolli consentono l’incorporazione diretta delle proteine 5,6,7, RNA 8,9,10 o lipidi11,12,13 nella rete di gel alterando l’ancoraggio chimico o espandendo ulteriormente il campione (migliorando così la risoluzione effettiva) in un singolo passaggio14 o in più passaggi iterativi15,16. Fino a poco tempo fa, nessun singolo protocollo ExM poteva mantenere queste tre classi di biomolecole con un singolo ancoraggio chimico disponibile in commercio, fornendo al contempo un gel meccanicamente robusto che poteva espandersi ~ 10 volte in un singolo ciclo di espansione.
Qui, presentiamo Magnify17, una recente aggiunta all’arsenale ExM che utilizza la metacroleina come ancoraggio della biomolecola. La metacroleina forma legami covalenti con tessuti come quello della paraformaldeide, assicurando che più classi di biomolecole possano essere trattenute all’interno della rete di gel senza richiedere vari agenti di ancoraggio specifici o personalizzati. Inoltre, questa tecnica può espandere un ampio spettro di tessuti fino a 11 volte, compresi campioni notoriamente impegnativi come campioni clinici fissati in formalina (FFPE). I metodi precedenti per espandere tali campioni meccanicamente rigidi richiedevano una dura digestione della proteasi, rendendo impossibile l’etichettatura anticorpale delle proteine di interesse dopo che il campione era stato espanso. Al contrario, questa tecnica raggiunge l’espansione dei campioni clinici FFPE utilizzando una soluzione denaturante calda, preservando così gli epitopi proteici interi all’interno del gel, che possono essere mirati per l’imaging post-espansione (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo il protocollo Magnify 17, una variante ExM che può trattenere più biomolecole con un singolo ancoraggio chimico ed espandere campioni clinici FFPE impegnativi fino a11 volte con denaturazione termica. I cambiamenti chiave in questo protocollo che lo distinguono da altri protocolli ExM includono l’uso di un gel riformulato che rimane meccanicamente robusto anche quando completamente espanso, così come l’uso di metacroleina come ancoraggio della biomolecola. I passaggi più criti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Carnegie Mellon University e dalla D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. e X.R.), dal National Institutes of Health (N.I.H.) Director’s New Innovator Award DP2 OD025926-01, e la Kauffman Foundation.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Riferimenti
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
