Universal molekylær retention med 11 gange ekspansionsmikroskopi
Summary
Præsenteret her er en ny version af ekspansionsmikroskopi (ExM), Magnify, der er modificeret til op til 11 gange ekspansion, bevarer et omfattende udvalg af biomolekyleklasser og er kompatibel med en bred vifte af vævstyper. Det muliggør forhør af nanoskalakonfigurationen af biomolekyler ved hjælp af konventionelle diffraktionsbegrænsede mikroskoper.
Abstract
Nanoskala billeddannelse af biologiske prøver kan forbedre forståelsen af sygdomspatogenese. I de senere år har ekspansionsmikroskopi (ExM) vist sig at være et effektivt og billigt alternativ til optisk superopløsningsmikroskopi. Det har imidlertid været begrænset af behovet for specifikke og ofte brugerdefinerede forankringsmidler til at bevare forskellige biomolekyleklasser i gelen og af vanskeligheder med at udvide standard kliniske prøveformater, såsom formalinfikseret paraffinindlejret væv, især hvis der ønskes større ekspansionsfaktorer eller konserverede proteinepitoper. Her beskriver vi Magnify, en ny ExM-metode til robust ekspansion op til 11 gange i en lang række vævstyper. Ved at bruge methacrolein som det kemiske anker mellem vævet og gelen bevarer Magnify flere biomolekyler, såsom proteiner, lipider og nukleinsyrer, i gelen, hvilket muliggør bred nanoskala billeddannelse af væv på konventionelle optiske mikroskoper. Denne protokol beskriver bedste praksis for at sikre robust og revnefri vævsudvidelse samt tip til håndtering og billeddannelse af stærkt ekspanderede geler.
Introduction
Biologiske systemer udviser strukturel heterogenitet, fra lemmerne og organerne ned til proteinniveauerne på nanoskala. Derfor kræver en fuldstændig forståelse af driften af disse systemer visuel undersøgelse på tværs af disse størrelsesskalaer. Imidlertid forårsager diffraktionsgrænsen for lys udfordringer med at visualisere strukturer mindre end ~ 200-300 nm på et konventionelt fluorescensmikroskop. Derudover giver optiske superopløsningsmetoder 1,2,3, såsom stimuleret emissionsudtømning (STED), fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM), stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM) og struktureret belysningsmikroskopi (SIM), selvom de er kraftfulde, deres egne udfordringer, da de kræver dyr hardware og reagenser og ofte har langsomme anskaffelsestider og en dårlig evne til at afbilde store mængder i 3D.
Ekspansionsmikroskopi4 (ExM) giver et alternativt middel til at omgå diffraktionsgrænsen for lys ved kovalent forankring af biomolekyler i en vandopsvulmelig polymergel og fysisk trække dem fra hinanden, hvilket gør dem opløselige på konventionelle optiske mikroskoper. Et væld af ExM-protokolvarianter er blevet udviklet siden den oprindelige offentliggørelse af ExM for mindre end et årti siden, og disse protokoller tillader direkte inkorporering af proteiner 5,6,7, RNA 8,9,10 eller lipider11,12,13 ind i gelnetværket ved at ændre det kemiske anker eller udvide prøven yderligere (hvilket forbedrer den effektive opløsning) enten i et enkelt trin14 eller flere iterative trin15,16. Indtil for nylig kunne ingen enkelt ExM-protokol bevare disse tre biomolekyleklasser med et enkelt kommercielt tilgængeligt kemisk anker, samtidig med at der blev tilvejebragt en mekanisk robust gel, der kunne udvide ~ 10 gange i en enkelt ekspansionsrunde.
Her præsenterer vi Magnify17, en nylig tilføjelse til ExM-arsenalet, der bruger methacrolein som biomolekyleanker. Methacrolein danner kovalente bindinger med væv som paraformaldehyd, hvilket sikrer, at flere klasser af biomolekyler kan bevares inden for gelnetværket uden at kræve forskellige specifikke eller brugerdefinerede forankringsmidler. Derudover kan denne teknik udvide et bredt spektrum af væv op til 11 gange, herunder notorisk udfordrende prøver såsom formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) kliniske prøver. Tidligere metoder til udvidelse af sådanne mekanisk stive prøver krævede hård proteasefordøjelse, hvilket gjorde antistofmærkning af proteiner af interesse umulig, efter at prøven var blevet udvidet. I modsætning hertil opnår denne teknik udvidelsen af FFPE kliniske prøver ved hjælp af en varm denatureringsopløsning, hvorved hele proteinepitoper bevares i gelen, som kan målrettes mod billeddannelse efter ekspansion (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi Magnify-protokollen 17, en ExM-variant, der kan bevare flere biomolekyler med et enkelt kemisk anker og udvide udfordrende FFPE kliniske prøver op til11 gange med varmedenaturering. De vigtigste ændringer i denne protokol, der adskiller den fra andre ExM-protokoller, inkluderer brugen af en omformuleret gel, der forbliver mekanisk robust, selv når den er fuldt udvidet, samt brugen af methacrolein som biomolekyleanker. De mest kritiske trin i denne protokol er som følger: 1)…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Carnegie Mellon University og D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. og X.R.), National Institutes of Health (N.I.H.) Director’s New Innovator Award DP2 OD025926-01 og Kauffman Foundation.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Riferimenti
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
