Universele moleculaire retentie met 11-voudige expansiemicroscopie
Summary
Hier wordt een nieuwe versie van expansiemicroscopie (ExM) gepresenteerd, Magnify, die is aangepast voor maximaal 11-voudige expansie, met behoud van een uitgebreide reeks biomolecuulklassen en compatibel is met een breed scala aan weefseltypen. Het maakt de ondervraging van de nanoschaalconfiguratie van biomoleculen mogelijk met behulp van conventionele diffractie-beperkte microscopen.
Abstract
De beeldvorming op nanoschaal van biologische specimens kan het begrip van ziektepathogenese verbeteren. In de afgelopen jaren is aangetoond dat expansiemicroscopie (ExM) een effectief en goedkoop alternatief is voor optische superresolutiemicroscopie. Het is echter beperkt door de behoefte aan specifieke en vaak aangepaste verankeringsmiddelen om verschillende biomolecuulklassen in de gel te behouden en door problemen met het uitbreiden van standaard klinische monsterformaten, zoals formaline-gefixeerd paraffine-ingebed weefsel, vooral als grotere expansiefactoren of geconserveerde eiwit-epitopen gewenst zijn. Hier beschrijven we Magnify, een nieuwe ExM-methode voor robuuste expansie tot 11-voudig in een breed scala aan weefseltypen. Door methacroleïne te gebruiken als het chemische anker tussen het weefsel en de gel, behoudt Magnify meerdere biomoleculen, zoals eiwitten, lipiden en nucleïnezuren, in de gel, waardoor de brede beeldvorming op nanoschaal van weefsels op conventionele optische microscopen mogelijk wordt. Dit protocol beschrijft best practices om robuuste en scheurvrije weefselexpansie te garanderen, evenals tips voor het hanteren en afbeelden van sterk uitgebreide gels.
Introduction
Biologische systemen vertonen structurele heterogeniteit, van de ledematen en de organen tot de niveaus van eiwitten op nanoschaal. Daarom vereist een volledig begrip van de werking van deze systemen visueel onderzoek op deze grootteschalen. De diffractielimiet van licht veroorzaakt echter uitdagingen bij het visualiseren van structuren kleiner dan ~ 200-300 nm op een conventionele fluorescentiemicroscoop. Bovendien vormen optische superresolutiemethoden 1,2,3, zoals gestimuleerde emissiedepletie (STED), foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM), stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM) en gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), hoewel krachtig, hun eigen uitdagingen, omdat ze dure hardware en reagentia vereisen en vaak trage acquisitietijden hebben en een slecht vermogen om grote volumes in 3D in beeld te brengen.
Expansiemicroscopie4 (ExM) biedt een alternatieve manier om de diffractielimiet van licht te omzeilen door biomoleculen covalent te verankeren in een wateropzwellende polymeergel en ze fysiek uit elkaar te trekken, waardoor ze oplosbaar worden op conventionele optische microscopen. Een groot aantal ExM-protocolvarianten zijn ontwikkeld sinds de oorspronkelijke publicatie van ExM minder dan tien jaar geleden, en deze protocollen maken de directe opname van eiwitten 5,6,7, RNA 8,9,10 of lipiden11,12,13 mogelijk in het gelnetwerk door het chemische anker te veranderen of het monster verder uit te breiden (waardoor de effectieve resolutie wordt verbeterd), hetzij in een enkele stap14 of meerdere iteratieve stappen15,16. Tot voor kort kon geen enkel ExM-protocol deze drie biomolecuulklassen behouden met een enkel commercieel verkrijgbaar chemisch anker, terwijl het een mechanisch stevige gel leverde die ~ 10-voudig kon uitzetten in een enkele uitbreidingsronde.
Hier presenteren we Magnify17, een recente toevoeging aan het ExM-arsenaal dat methacroleïne gebruikt als het biomolecuulanker. Methacroleïne vormt covalente bindingen met weefsel zoals dat van paraformaldehyde, waardoor meerdere klassen biomoleculen in het gelnetwerk kunnen worden gehouden zonder dat verschillende specifieke of aangepaste verankeringsmiddelen nodig zijn. Bovendien kan deze techniek een breed spectrum van weefsels tot 11-voudig uitbreiden, inclusief notoir uitdagende monsters zoals formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) klinische monsters. Eerdere methoden voor het uitbreiden van dergelijke mechanisch stijve monsters vereisten een harde proteasevertering, waardoor de antilichaametikettering van eiwitten van belang onmogelijk werd nadat het monster was uitgebreid. Deze techniek daarentegen bereikt de uitbreiding van FFPE klinische monsters met behulp van een hete denatureringsoplossing, waardoor hele eiwit-epitopen in de gel behouden blijven, die kunnen worden gericht op beeldvorming na uitbreiding (figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we het Magnify-protocol17, een ExM-variant die meerdere biomoleculen kan vasthouden met een enkel chemisch anker en uitdagende FFPE-klinische monsters tot 11-voudig kan uitbreiden met warmtedenaturatie. De belangrijkste veranderingen in dit protocol die het onderscheiden van andere ExM-protocollen zijn het gebruik van een geherformuleerde gel die mechanisch robuust blijft, zelfs wanneer het volledig is uitgebreid, evenals het gebruik van methacroleïne als het biomolecuulanker. De…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Carnegie Mellon University en de D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. en X.R.), de National Institutes of Health (N.I.H.) Director’s New Innovator Award DP2 OD025926-01, en de Kauffman Foundation.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Riferimenti
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
