Universelle molekulare Retention mit 11-facher Expansionsmikroskopie
Summary
Hier wird eine neue Version der Expansionsmikroskopie (ExM), Magnify, vorgestellt, die für eine bis zu 11-fache Expansion modifiziert wurde, eine umfassende Palette von Biomolekülklassen bewahrt und mit einer Vielzahl von Gewebetypen kompatibel ist. Es ermöglicht die Untersuchung der nanoskaligen Konfiguration von Biomolekülen mit herkömmlichen beugungsbegrenzten Mikroskopen.
Abstract
Die nanoskalige Bildgebung biologischer Proben kann das Verständnis der Krankheitspathogenese verbessern. In den letzten Jahren hat sich die Expansionsmikroskopie (ExM) als effektive und kostengünstige Alternative zur optischen Superauflösungsmikroskopie erwiesen. Sie wurde jedoch durch den Bedarf an spezifischen und oft kundenspezifischen Verankerungsmitteln zur Beibehaltung verschiedener Biomolekülklassen im Gel und durch Schwierigkeiten bei der Erweiterung klinischer Standardprobenformate, wie z. B. formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe, eingeschränkt, insbesondere wenn größere Expansionsfaktoren oder konservierte Proteinepitope gewünscht werden. Hier beschreiben wir Magnify, eine neue ExM-Methode zur robusten bis zu 11-fachen Expansion in einer Vielzahl von Gewebetypen. Durch die Verwendung von Methacrolein als chemischer Anker zwischen dem Gewebe und dem Gel hält Magnify mehrere Biomoleküle wie Proteine, Lipide und Nukleinsäuren im Gel zurück und ermöglicht so die breite nanoskalige Abbildung von Geweben auf herkömmlichen optischen Mikroskopen. Dieses Protokoll beschreibt Best Practices, um eine robuste und rissfreie Gewebeexpansion zu gewährleisten, sowie Tipps für die Handhabung und Bildgebung von stark expandierten Gelen.
Introduction
Biologische Systeme weisen strukturelle Heterogenität auf, von den Gliedmaßen und Organen bis hin zu Proteinen auf der Nanoskala. Daher erfordert ein vollständiges Verständnis der Funktionsweise dieser Systeme eine visuelle Untersuchung über diese Größenskalen hinweg. Die Beugungsgrenze des Lichts stellt jedoch eine Herausforderung bei der Visualisierung von Strukturen dar, die kleiner als ~200-300 nm auf einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop sind. Darüber hinaus stellen optische Superauflösungsmethoden 1,2,3, wie z. B. die stimulierte Emissionsverarmung (STED), die photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie (PALM), die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), zwar ihre eigenen Herausforderungen dar, da sie teure Hardware und Reagenzien erfordern und oft langsame Aufnahmezeiten und eine schlechte Fähigkeit haben, große Mengen in 3D abzubilden.
Die Expansionsmikroskopie4 (ExM) bietet eine alternative Möglichkeit, die Beugungsgrenze des Lichts zu umgehen, indem Biomoleküle kovalent in einem wasserquellfähigen Polymergel verankert und physikalisch auseinandergezogen werden, wodurch sie auf herkömmlichen optischen Mikroskopen auflösbar werden. Seit der ursprünglichen Veröffentlichung von ExM vor weniger als einem Jahrzehnt wurde eine Vielzahl von ExM-Protokollvarianten entwickelt, die den direkten Einbau der Proteine 5,6,7, RNA 8,9,10 oder Lipide11,12,13 ermöglichen in das Gelnetzwerk durch Verändern des chemischen Ankers oder weiteres Erweitern der Probe (wodurch die effektive Auflösung verbessert wird) entweder in einem einzigen Schritt14 oder in mehreren iterativen Schritten15,16. Bis vor kurzem konnte kein einzelnes ExM-Protokoll diese drei Biomolekülklassen mit einem einzigen kommerziell erhältlichen chemischen Anker beibehalten und gleichzeitig ein mechanisch robustes Gel bereitstellen, das sich in einer einzigen Expansionsrunde ~10-fach ausdehnen konnte.
Hier stellen wir Magnify17 vor, eine neue Ergänzung des ExM-Arsenals, die Methacrolein als Biomolekülanker verwendet. Methacrolein bildet kovalente Bindungen mit Gewebe wie Paraformaldehyd und stellt sicher, dass mehrere Klassen von Biomolekülen innerhalb des Gelnetzwerks erhalten bleiben können, ohne dass verschiedene spezifische oder kundenspezifische Verankerungsmittel erforderlich sind. Darüber hinaus kann diese Technik ein breites Spektrum von Geweben um das bis zu 11-fache erweitern, einschließlich notorisch schwieriger Proben wie formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) klinische Proben. Bisherige Methoden zur Expansion solcher mechanisch starren Proben erforderten einen harten Proteaseverstand, was die Antikörpermarkierung von Proteinen von Interesse nach der Expansion der Probe unmöglich machte. Im Gegensatz dazu wird mit dieser Technik die Expansion klinischer FFPE-Proben mit einer heißen Denaturierungslösung erreicht, wodurch ganze Proteinepitope im Gel erhalten bleiben, die für die Bildgebung nach der Expansion gezielt eingesetzt werden können (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir das Magnify-Protokoll17 vor, eine ExM-Variante, die mehrere Biomoleküle mit einem einzigen chemischen Anker zurückhalten und anspruchsvolle klinische FFPE-Proben durch Hitzedenaturierung bis zu 11-fach erweitern kann. Zu den wichtigsten Änderungen in diesem Protokoll, die es von anderen ExM-Protokollen unterscheiden, gehören die Verwendung eines neu formulierten Gels, das auch bei vollständiger Expansion mechanisch robust bleibt, sowie die Verwendung von Methacrolein als Biom…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Carnegie Mellon University und der D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. und X.R.), den National Institutes of Health (N.I.H.) Director’s New Innovator Award DP2 OD025926-01 und der Kauffman Foundation.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Riferimenti
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