Retenção molecular universal com microscopia de expansão de 11 vezes
Summary
Apresentamos aqui uma nova versão da microscopia de expansão (ExM), Magnify, que é modificada para expansão de até 11 vezes, conservando uma ampla gama de classes de biomoléculas, e é compatível com uma ampla gama de tipos de tecidos. Ele permite a interrogação da configuração em nanoescala de biomoléculas usando microscópios convencionais limitados por difração.
Abstract
A obtenção de imagens em nanoescala de espécimes biológicos pode melhorar a compreensão da patogênese de doenças. Nos últimos anos, a microscopia de expansão (ExM) tem se mostrado uma alternativa eficaz e de baixo custo à microscopia óptica de super-resolução. No entanto, tem sido limitada pela necessidade de agentes de ancoragem específicos e muitas vezes personalizados para reter diferentes classes de biomoléculas dentro do gel e por dificuldades com a expansão de formatos de amostras clínicas padrão, como tecido fixado em formalina e embebido em parafina, especialmente se fatores de expansão maiores ou epítopos proteicos preservados forem desejados. Aqui, descrevemos o Magnify, um novo método ExM para expansão robusta de até 11 vezes em uma ampla gama de tipos de tecido. Ao usar a metacroleína como âncora química entre o tecido e o gel, o Magnify retém múltiplas biomoléculas, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, dentro do gel, permitindo assim a obtenção de imagens em larga escala nanoescala dos tecidos em microscópios ópticos convencionais. Este protocolo descreve as melhores práticas para garantir uma expansão de tecido robusta e livre de rachaduras, bem como dicas para manuseio e geração de imagens de géis altamente expandidos.
Introduction
Os sistemas biológicos exibem heterogeneidade estrutural, desde os membros e órgãos até os níveis de proteínas na nanoescala. Portanto, uma compreensão completa do funcionamento desses sistemas requer um exame visual através dessas escalas de tamanho. No entanto, o limite de difração da luz causa desafios na visualização de estruturas menores que ~200-300 nm em um microscópio de fluorescência convencional. Além disso, os métodos ópticos de super-resolução 1,2,3, como a depleção de emissão estimulada (STED), a microscopia de localização fotoativada (PALM), a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e a microscopia de iluminação estruturada (SIM), embora poderosos, apresentam seus próprios desafios, pois requerem hardware e reagentes caros e, muitas vezes, têm tempos de aquisição lentos e baixa capacidade de obter imagens de grandes volumes em 3D.
A microscopia de expansão4 (ExM) fornece um meio alternativo de contornar o limite de difração da luz ancorando covalentemente biomoléculas em um gel de polímero intumescível em água e separando-as fisicamente, tornando-as resolúveis em microscópios ópticos convencionais. Uma infinidade de variantes do protocolo ExM foi desenvolvida desde a publicação original do ExM há menos de uma década, e esses protocolos permitem a incorporação direta de proteínas 5,6,7, RNA 8,9,10 ou lipídios11,12,13 na rede de gel, alterando a âncora química ou expandindo ainda mais a amostra (melhorando assim a resolução efetiva) em um único passo14 ou em vários passos iterativos15,16. Até recentemente, nenhum protocolo ExM poderia reter essas três classes de biomoléculas com uma única âncora química comercialmente disponível, fornecendo um gel mecanicamente resistente que poderia se expandir ~10 vezes em uma única rodada de expansão.
Aqui, apresentamos a Magnify17, uma adição recente ao arsenal ExM que usa metacroleína como âncora de biomolécula. A metacroleína forma ligações covalentes com tecidos como o do paraformaldeído, garantindo que várias classes de biomoléculas possam ser retidas dentro da rede de gel sem a necessidade de vários agentes de ancoragem específicos ou personalizados. Além disso, essa técnica pode expandir um amplo espectro de tecidos em até 11 vezes, incluindo amostras notoriamente desafiadoras, como amostras clínicas fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE). Métodos anteriores para expandir tais amostras mecanicamente rígidas exigiam digestão severa de proteases, tornando impossível a marcação de anticorpos de proteínas de interesse após a amostra ter sido expandida. Em contraste, esta técnica consegue a expansão de amostras clínicas FFPE usando uma solução desnaturante a quente, preservando assim epítopos de proteína inteira dentro do gel, que podem ser alvo de imagem pós-expansão (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos o protocolo Magnify 17, uma variante de ExM que pode reter múltiplas biomoléculas com uma única ancoragem química e expandir espécimes clínicos FFPE desafiadores até11 vezes com desnaturação térmica. As principais mudanças neste protocolo que o distinguem de outros protocolos ExM incluem o uso de um gel reformulado que permanece mecanicamente robusto mesmo quando totalmente expandido, bem como o uso de metacroleína como âncora da biomolécula. As etapas mais crític…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Carnegie Mellon University e pela D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. e X.R.), pelo National Institutes of Health (N.I.H.) Prêmio Novo Inovador do Diretor DP2 OD025926-01 e Fundação Kauffman.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Riferimenti
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
