التحويلات اليومية وأرشفة السكان وقياس اللياقة البدنية في تجربة التطور طويلة المدى مع الإشريكية القولونية

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية الحفاظ على تجربة تطور الإشريكية القولونية طويلة الأجل (LTEE) من خلال إجراء عمليات النقل اليومية والتجميد الدوري وكيفية إجراء فحوصات المنافسة لقياس تحسينات اللياقة البدنية في البكتيريا المتطورة. يمكن أن تكون هذه الإجراءات بمثابة نموذج للباحثين الذين يبدأون تجارب التطور الميكروبي الخاصة بهم.

Abstract

تابعت تجربة التطور طويلة المدى (LTEE) اثني عشر مجموعة من الإشريكية القولونية حيث تكيفت مع بيئة مختبرية بسيطة لأكثر من 35 عاما و 77000 جيل بكتيري. يجسد الإعداد والإجراءات المستخدمة في LTEE طرقا موثوقة وقابلة للتكرار لدراسة التطور الميكروبي. في هذا البروتوكول ، نصف أولا كيف يتم نقل مجموعات LTEE إلى وسط جديد واستزراعها كل يوم. بعد ذلك ، نصف كيف يتم فحص مجموعات LTEE بانتظام بحثا عن علامات التلوث المحتملة وأرشفتها لتوفير “سجل أحفوري” دائم مجمد لدراسته لاحقا. تم تصميم ضمانات متعددة مضمنة في هذه الإجراءات لمنع التلوث ، واكتشاف المشكلات المختلفة عند حدوثها ، والتعافي من الاضطرابات دون حدوث إعاقة ملحوظة لتقدم التجربة. إحدى الطرق التي يتم بها مراقبة الإيقاع العام وطبيعة التغيرات التطورية في LTEE هي قياس اللياقة التنافسية للسكان والسلالات من التجربة. نصف كيفية إجراء فحوصات المنافسة في الثقافة المشتركة ونوفر كلا من جدول البيانات وحزمة R (fitnessR) لحساب اللياقة النسبية من النتائج. على مدار LTEE ، تغيرت سلوكيات بعض السكان بطرق مثيرة للاهتمام ، ووفرت التقنيات الجديدة مثل تسلسل الجينوم الكامل سبلا إضافية للتحقيق في كيفية تطور السكان. نختتم بمناقشة كيفية تحديث إجراءات LTEE الأصلية لاستيعاب هذه التغييرات أو الاستفادة منها. سيكون هذا البروتوكول مفيدا للباحثين الذين يستخدمون LTEE كنظام نموذجي لدراسة الروابط بين التطور وعلم الوراثة والبيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الأنظمة والبيئة. على نطاق أوسع ، يوفر LTEE نموذجا مجربا وصحيحا لأولئك الذين يبدأون تجارب التطور الخاصة بهم مع الميكروبات والبيئات والأسئلة الجديدة.

Introduction

في فبراير من عام 1988 ، قام ريتشارد لينسكي بتلقيح اثني عشر قارورة تحتوي على وسط نمو محدود الجلوكوز مع مزارع نسيلية من الإشريكية القولونية في جامعة كاليفورنيا ، إيرفين¹. في اليوم التالي ، نقل 1٪ من الثقافة من كل قارورة إلى مجموعة من القوارير الجديدة التي تحتوي على وسط نمو جديد. سمح هذا التخفيف بنسبة 1: 100 لمجموعات البكتيريا بالتوسع 100 ضعف قبل استنفاد الجلوكوز المتاح ، وهو ما يعادل حوالي 62/3 أجيال من انقسامات الخلايا. تم تكرار هذا الإجراء في اليوم التالي وكان كل يوم منذ ذلك الحين ، مع بعض الانقطاعات. استمرت عمليات النقل اليومية هذه ، حتى مع نقل التجربة ، أولا إلى جامعة ولاية ميشيغان في عام 1992 ، ثم إلى جامعة تكساس في أوستن في عام 2022. طوال الوقت ، ولدت الطفرات الجديدة باستمرار تباينا وراثيا في مجموعات الإشريكية القولونية هذه ، وأدى الانتقاء الطبيعي إلى خلايا متطورة تتفوق على أسلافها.

صمم لينسكي هذه التجربة ، المعروفة الآن باسم تجربة التطور طويلة المدى (LTEE) ، للتحقيق في ديناميكيات التطور وتكراره. للإجابة على هذه الأسئلة ، قام بتضمين العديد من الميزات المهمة في تصميم الإعداد التجريبي وبروتوكولاته². واحدة من هذه الميزات كانت الاختيار الدقيق لكائن نموذجي. بدأت جميع المجموعات السكانية الاثني عشر الأصلية من مستعمرات فردية تشترك في سلف مشترك مباشر ، سلالة الإشريكية القولونية B REL606. تم اختيار هذه السلالة لأنها كانت شائعة الاستخدام بالفعل في إعدادات المختبر ، وتم استنساخها بشكل لا جنسي تماما ، ولا تحتوي على بلازميدات أو نبوءات سليمة ^3,4 – وكلها تجعل دراسة تطورها أكثر بساطة. كان الخيار الآخر الذي بسط التجربة هو استخدام تركيز منخفض جدا من الجلوكوز في وسط النمو للحد من كثافة الخلايا في كل دورق بعد النمو. كان الهدف من استخدام كثافة الخلايا المنخفضة هو تسهيل تحليل التغيرات في اللياقة السكانية عن طريق تقليل احتمالية تطور التفاعلات البيئية داخل السكان (على سبيل المثال ، عن طريق التغذية المتبادلة)⁵.

REL606 غير قادر على استخدام أرابينوز كمصدر للكربون والطاقة (Ara⁻) بسبب طفرة نقطية في جين araA. قبل بدء LTEE ، تم عزل متحولة عفوية مع تسلسل araA مستعاد ، المسمى REL607 ، من REL606⁶. REL607 قادر على النمو على أرابينوز (آرا ⁺). تم استخدام REL606 لبدء ستة من مجموعات LTEE ، وتم استخدام REL607 لبدء الستة الآخرين. أرابينوز غير موجود في وسط النمو المستخدم خلال LTEE ، لذلك يتصرف REL607 مثل REL606 في ظل هذه الظروف. ومع ذلك ، عند الطلاء على أجار رباعي أرابينوز (TA) ، تشكل خلايا Ara⁻ و Ara ⁺ مستعمرات حمراء وبيضاء ، على التوالي. هذه الطريقة للتمييز بين سلالتين من الإشريكية القولونية وأحفادهما مفيدة للغاية. يمكن استخدامه للكشف عن التلوث المتبادل بين مجموعات LTEE. كما أنه يساعد في قياس لياقة سلالة Ara− أو السكان بالنسبة ^{إلى سلالة Ara+} عندما يتنافسون ضد بعضهم البعض. يتم قياس اللياقة من خلال إنشاء ثقافة مشتركة للمنافسين المميزين بشكل معاكس ثم مراقبة كيفية تغير ترددات المستعمرات الحمراء والبيضاء (التي يتم الحصول عليها عن طريق نشر تخفيفات الثقافة على لوحات TA) بين وقت خلط المنافسين في البداية وبعد دورة نمو واحدة أو أكثر في ظل نفس الظروف مثل LTEE. سيزداد تمثيل نوع الخلية الأكثر ملاءمة خلال كل دورة نمو.

ميزة أخرى حاسمة ل LTEE هي أن عينات من السكان المتطورين يتم أرشفتها بشكل دوري. عند مزجها مع مادة واقية من البرودة مثل الجلسرين ، يمكن تجميد خلايا الإشريكية القولونية وإحيائها لاحقا⁷. كجزء من بروتوكول LTEE ، كل يوم 75 (أي ما يعادل ما يقرب من 500 جيل) ، يتم خلط جزء من كل مجموعة لم يتم نقلها إلى قارورة جديدة مع الجلسرين ، وتقسيمها بين قوارير متعددة ، وتخزينها في الثلاجة. مكن هذا “السجل الأحفوري” المجمد الباحثين من إجراء الدراسات الأولى ل LTEE ، حيث قاموا بإحياء مجموعات E. coli المتطورة من نقاط زمنية مختلفة وتنافسوا عليها مقابل سلالات الأجداد لتتبع مدى سرعة زيادة اللياقة^{البدنية 1}. تم إعادة قياس تطور اللياقة البدنية بشكل دوري حيث تم الحفاظ على المزيد من “طبقات” “السجل الأحفوري” المجمد. الاستنتاج العام من هذه القياسات هو أن اللياقة البدنية تستمر في التحسن في LTEE حتى يومنا هذا ، حتى بعد أجيال عديدة من التطور في نفس البيئة^8،9،10.

ما الذي سمح ل LTEE بالاستمرار لفترة طويلة؟ العديد من الميزات نفسها التي مكنت من طرح أسئلتها الأصلية والإجابة عليها كانت أيضا بمثابة تدابير أمان وأمان ضد الاضطرابات الحتمية بسبب سوء الحظ والخطأ البشري والأحداث العالمية. كل يوم ، عندما يتم نقل الثقافات إلى وسط نمو جديد ، يتناوب الباحث الذي يقوم بعمليات النقل بين مجموعات Ara⁻ و Ara⁺ . بعد ذلك ، عندما يتم تجميد السكان ، يمكن طلاءهم على أجار انتقائي ومؤشر للتحقق مما إذا كانت أي مجموعات “مجاورة” قد تلوثت أو اختلطت عن طريق الخطأ (على سبيل المثال ، المستعمرات البيضاء موجودة في مجموعة يجب أن تشكل مستعمرات حمراء فقط) أو ملوثة بميكروبات غريبة (على سبيل المثال ، مورفولوجيا مستعمرة غير متوقعة أو كثافة خلية). في حالة تعرض السكان للخطر ، يمكن إحياء سلفه من الثلاجة ونقله في مكانه. وبالتالي ، فإن علامات Ara والأرشيف المجمد تخدم أغراضا مزدوجة كموارد تجريبية وتدابير سلامة.

نظرا لأن تاريخها محفوظ جيدا ويمكن الوصول إليه بسهولة ، فقد تمت دراسة عينات LTEE باستخدام تقنيات لم تكن موجودة عندما بدأت التجربة. على سبيل المثال ، تم استخدام تسلسل الجينوم الكامل لفحص ديناميكيات الطفرات في مجموعات LTEE¹¹،12،^13،14،15 ، وتم استخدام علم النسخ والتنميط الريبوسومي لفحص التغيرات في التعبير الجيني^16،17. تم استخدام الأدوات الجينية لإعادة بناء السلالات التي تختلف عن طريق الطفرات المفردة أو مجموعات من العديد من الطفرات المتطورة لفهم آثارها على اللياقة البدنية والأنماط الظاهرية المختلفة¹⁸،¹⁹،^20،21. يتم تجديد العينات من “السجل الأحفوري” المجمد بسهولة بحيث يمكن شحن أجزاء من أو نسخ كاملة من تاريخ التجربة إلى مختبرات أخرى. توجد عينات LTEE الآن في جميع القارات باستثناء القارة القطبية الجنوبية ، ويتم دراستها من قبل باحثين أصغر سنا من التجربة نفسها. كما كانت الطرق القوية ل LTEE وعينات وسلالات الإشريكية القولونية المتطورة من سجلها التاريخي بمثابة نقاط انطلاق لتجارب التطور التي تدرس الأسئلة والبيئات الأخرى 22،²³،^24،25،26،27،^28،29.

الشكل 1: نظرة عامة على إجراءات LTEE. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هنا ، نوضح ثلاثة بروتوكولات أساسية مستخدمة في تجربة تطور الإشريكية القولونية طويلة المدى (الشكل 1). وصفنا: (1) كيفية إجراء عمليات النقل اليومية ، (2) كيفية أرشفة عينات السكان والعزلات النسيلية ، و (3) كيفية إجراء وتحليل مقايسات المنافسة في الثقافة المشتركة لقياس اختلافات اللياقة البدنية. نأمل أن تعزز هذه البروتوكولات الاستخدام المستمر لموارد LTEE وإبلاغ تصميم تجارب التطور الميكروبي الجديدة.

Protocol

1. التحويلات اليومية لسكان LTEE ملاحظة: يتم نقل مجموعات LTEE الاثني عشر يوميا عن طريق تلقيح وسط جديد بنسبة 1٪ من الثقافات من قوارير اليوم السابق. يتم تلخيص الخطوات في هذه العملية في الشكل 1. تم تعيين مجموعات Ara− الستة التي بدأت من سلالة REL606 من A−1 إلى A−6 ، وتم تعيين مجموعات Ara + الستة التي بدأت من سلالة REL607 A + 1 إلى A + 6. إن الالتزام الصارم بتقنية التعقيم والجدول الزمني والنظام الزمني لنقل السكان يقلل من خطر التلوث والاضطرابات الأخرى. قم بتطهير السطح الذي سيتم إجراء عمليات نقل LTEE عليه عن طريق مسحه إما بالإيثانول بنسبة 70٪ أو محلول التبييض بنسبة 10٪. أشعل موقد بنسن لإنشاء تيار صاعد محلي وتمكين اشتعال الأواني الزجاجية.ملاحظة: ارتد قفازات المختبر لمنع التلوث. من أجل السلامة حول اللهب المكشوف ، من الأهمية بمكان استخدام القفازات المصنوعة من مادة مثل النتريل غير القابلة للاشتعال فقط. قم بإعداد ثلاثة عشر قارورة من البورسليكات Erlenmeyer سعة 50 مل مغطاة بكؤوس البورسليكات أو البولي بروبيلين سعة 20 مل والتي تم غسلها وتعقيمها بواسطة التعقيم. افحص القوارير بحثا عن الحطام المرئي واستبدل أي قوارير غير نظيفة تماما. قم بتسمية ست قوارير من A−1 إلى A−6 باستخدام علامة حمراء والقوارير الست الأخرى من A + 1 إلى A + 6 باستخدام علامة سوداء. قم بتسمية آخر دورق متبق ، والذي سيكون فارغا ، مع التاريخ بتنسيق الشهر / اليوم ويوم الأسبوع. املأ كل قارورة من القوارير ال 13 ب 9.9 مل من وسط DM25 باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 10 مل. أشعل فم كل دورق بعد إزالة الدورق الذي يعمل كغطاء وقبل استبدال الدورق. لهب طرف الماصة بين ملء كل قارورة.ملاحظة: تعليمات صنع DM25 متوفرة عبر الإنترنت30. إذا كنت تستخدم ماصة مصلية بلاستيكية ، فتخلى عن إشعال طرفها أو قلل من الوقت في اللهب لتجنب ذوبان البلاستيك. قم بإزالة قوارير LTEE في اليوم السابق من حاضنة الاهتزاز. افحص كل قارورة عن طريق رفعها إلى الضوء لتقييم تعكرها ولونها ، والتحقق من سلامة القارورة ، والبحث عن وجود مادة غريبة.ملاحظة: بالعين المجردة ، ستبدو جميع ثقافات Ara− و Ara+ عكرة قليلا مقارنة بالفراغ ، باستثناء A−3 ، والتي ستكون ~ 10 أضعاف أكثر تعكرا من غيرها بسبب النمو على السيترات في الوسط. العديد من الملوثات الميكروبية الخارجية قادرة أيضا على النمو على السيترات ، لذلك من المحتمل أن تشير زيادة التعكر في مجموعات أخرى غير A − 3 إلى التلوث. راجع قسم النتائج التمثيلية للحصول على صور لثقافات LTEE قبل النقل. اختياري: تأكد من أن كل مزرعة LTEE لديها التعكر المتوقع عن طريق سحب 1 مل من الفراغ و 1 مل من كل مزرعة في أكواب بلاستيكية 1 سم وأخذ قراءات الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD600) باستخدام مقياس الطيف الضوئي بعد إفراغ الجهاز.ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة الإضافية مفيدة للباحثين الجدد في العمل مع LTEE وغير متأكدين من الحكم على التعكر بالعين ، وكذلك لتوثيق الحالات الشاذة المشتبه بها والتحقيق فيها. خذ عينات لقياس OD600 من قوارير اليوم السابق فقط بعد الانتهاء من عمليات النقل العادية لليوم إلى قوارير جديدة (الخطوات التالية) لتقليل خطر تلويث مجموعات الخلايا التي ستستمر في الانتشار إذا كانت قيم OD600 كما هو متوقع. راجع قسم النتائج التمثيلية للحصول على قيم OD600 النموذجية لثقافات LTEE. باستخدام أنبوب دقيق P200 مع طرف مرشح معقم ، انقل 100 ميكرولتر من الثقافة من كل دورق LTEE إلى الدورق المقابل الذي يحتوي على DM25 طازجا. ابدأ ب A−1 ، ثم انقل A + 1. بعد ذلك ، استمر في التناوب بين السكان – و +. لتتبع الثقافات التي تم نقلها ، قم بإزاحة القوارير إلى اليسار بعد سحب السحب منها أو إليها.ملاحظة: يساعد الترتيب الصارم لعمليات النقل والتناوب بين مجموعات Ara− و Ara + في منع واكتشاف التلوث المتبادل والاختلاط. التزم بتقنية التعقيم الصارمة: استخدم طرف ماصة جديد لكل عملية نقل ، وقم بإشعال أفواه القوارير فور فك الغطاء وقبل إعادة التغليف ، وامسح البرميل وقاذف الماصة الدقيقة بمنديل ورقي خال من النسالة مبلل بنسبة 70٪ إيثانول بين كل عملية نقل. لا ينبغي أبدا استخدام المبيض لتطهير الأنابيب الدقيقة ، حيث أن الكميات الضئيلة يمكن أن تقتل الثقافات. احتضان القوارير الملقحة حديثا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ± 1 ساعة مع اهتزاز مداري 120 دورة في الدقيقة على قطر 1 بوصة. قم بتخزين الثقافات من اليوم السابق في درجة حرارة 4 درجات مئوية. احتفظ بثقافات النسخ الاحتياطي هذه لمدة يومين. تجاهل الثقافات القديمة التي تم حفظها عند 4 درجات مئوية قبل ثلاثة أيام في هذا الوقت.ملاحظة: توفر ثقافات اليومين السابقين مجموعتين كاملتين من النسخ الاحتياطية التي يمكن من خلالها إعادة تشغيل التجربة ، إذا لزم الأمر ، في حالة حدوث أي مشكلة أو حادث ، أو إذا تم اكتشاف تلوث مزارع اليوم السابق قبل النقل (على سبيل المثال ، تلوين غريب أو جسيمات غير متوقعة). أدخل الوقت أو التاريخ أو رقم التحويل أو الاسم أو الأحرف الأولى للباحث الذي قام بالتحويلات ، سواء كانت الثقافات على ما يرام أم لا ، وأي معلومات أخرى ذات صلة في دفتر سجل التحويل. انتقل إلى الخطوات 1.12-1.14 في حالة حدوث أي من المواقف التالية: (1) الفراغ من اليوم السابق ملوث ، (2) قارورة أو غطاءها متصدع أو مكسور ، (3) قارورة تحتوي على مواد غريبة ، (4) قارورة مقلوبة أو تسقط أثناء عمليات النقل ، أو (5) هناك أي حدث أو ملاحظة أخرى تجعل الاستمرار من هذه القوارير مشكوكا فيه. إذا كانت هناك أي مشاكل أو حوادث أو شكوك حول التلوث بثقافات LTEE في اليوم السابق ، فلا تنقل منها. بدلا من ذلك ، قم بتخزين المجموعة الكاملة من اثنتي عشرة مزرعة عند 4 درجات مئوية لفحصها لاحقا وتوصيفها بشكل أكبر. استرجع القوارير التي تحتوي على الثقافات الاحتياطية التي تم نقلها من اليوم السابق وتخزينها في 4 درجات مئوية. ضعها على سطح الطاولة لتسخن إلى درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير كل قارورة برفق لإعادة تعليق الخلايا. انقل من القوارير الاحتياطية إلى المجموعة الجديدة من القوارير التي تحتوي على وسط جديد واستمر في التجربة بشكل طبيعي كما هو موضح في الخطوات 1.6-1.11. قم بتدوين ملاحظة في سجل النقل بأنه تم استخدام ثقافات النسخ الاحتياطي وسجل نفس رقم التحويل كما في اليوم السابق.ملاحظة: حتى إذا لوحظت مشكلة في دورق مجموعة سكانية واحدة فقط ، فقم بنقل جميع المجموعات الاثني عشر من القوارير الاحتياطية بحيث يظل عدد الأجيال التي انقضت في جميع المجموعات السكانية في الطور. إذا لوحظ تلوث في القوارير الاحتياطية المخزنة عند 4 درجات مئوية ، فيجب إعادة تشغيل مجموعات LTEE المصابة من المخزونات المجمدة باستخدام الإجراء الموضح في الخطوات 3.1-3.2 لعينات السكان. لا ينبغي زيادة رقم التحويل ل LTEE حتى نمو الثقافات الأولى في DM25 بعد الإحياء. 2. أرشفة مجموعات LTEE ملاحظة: يتم تجميد عينات من مجموعات LTEE كل 75 عملية نقل. ينمو السكان ~ 6 2/3 أجيال كل يوم بعد تخفيف النقل 100 ضعف ، وبالتالي فإن هذه الفترة تتوافق مع ~ 500 جيل. أثناء الأرشفة ، يتم أيضا طلاء مجموعات LTEE على أنواع مختلفة من وسائط أجار للتحقق من التلوث. اختياريا ، يمكن اختيار الحيوانات المستنسخة التمثيلية من هذه اللوحات وأرشفتها في هذا الوقت. يتم تلخيص هذه الخطوات في الشكل 1. في اليوم السابق للتجميد المخطط له أو قبل أيام قليلة ، قم بإعداد ثلاثة أنواع من ألواح أجار: الحد الأدنى من الجلوكوز (MG) ، والحد الأدنى من أرابينوز (MA) ، و Tetrazolium Arabinose (TA). اصنع اثني عشر طبقا من كل نوع من أنواع الأجار ، بالإضافة إلى بعض الإضافات. قم أيضا بإعداد ما لا يقل عن 250 مل من محلول ملحي معقم 0.85٪ (وزن / حجم) و 50 مل من 80٪ (v / v) من الجلسرين المعقم.ملاحظة: تتوفر وصفات لجميع الوسائط والحلول عبر الإنترنت30. اليوم الذي يسبق وصول LTEE إلى جيل من مضاعفات 500 لجدول الأرشفة العاديهو اليوم 74 منذ آخر تجميد بالإضافة إلى أي أيام تمت إضافتها بسبب عمليات النقل من قوارير احتياطية 4 درجات مئوية عند اكتشاف المشاكل أو الاشتباه فيها. اختياري: إذا كانت أرشفة العزلات النسيلية من مجموعات LTEE ، فقم بإعداد إمدادات إضافية: يتطلب عزل ثلاثة مستنسخات من كل مجموعة 72 لوحة MG ، و 80 مل من 80٪ (v / v) من الجلسرين ، و 370 مل من DM1000. قم بإعداد مجموعة إضافية من اثني عشر قارورة عند تنفيذ الخطوة 1.2 من عمليات نقل LTEE اليومية في اليوم السابق للتجميد المخطط له. قم بتسمية ستة من القوارير الإضافية من xA−1 إلى xA−6 باستخدام علامة حمراء ، والستة الأخرى xA + 1 إلى xA + 6 باستخدام علامة سوداء.ملاحظة: يشير الحرف “x” إلى أنه سيتم استخدام مجموعة إضافية من القوارير للأرشفة ويميزها عن المجموعة الأخرى من القوارير التي سيتم استخدامها لمواصلة عمليات النقل اليومية ل LTEE بالتوازي. املأ كل من القوارير الإضافية التي سيتم استخدامها للأرشفة ب 14.85 مل من DM25 باستخدام ماصة مصلية 25 مل عند تنفيذ الخطوة 1.4 من عمليات نقل LTEE اليومية. أكمل نقل LTEE العادي كما هو موضح في الخطوات 1.5-1.11. بعد ذلك ، كرر التعليمات الخاصة بالخطوة 1.8 ، ولكن هذه المرة انقل 150 ميكرولتر من كل من ثقافات LTEE في اليوم السابق إلى قوارير إضافية تبلغ 14.85 مل من DM25 الطازج الذي سيتم استخدامه للأرشفة.ملاحظة: في هذه الخطوة وجميع الخطوات اللاحقة ، تجنب التلوث والاختلاط باتباع هذه الإرشادات. ابدأ بالسكان A−1 ، ثم انقل A + 1 ، ثم استمر في التناوب – و + السكان. امسح البرميل وقاذف الماصة الدقيقة بمنديل ورقي خال من النسالة مبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول عند تبديل السكان. قم بنقل القوارير وأنابيب الاختبار في الصواني أو الرفوف بعد السحب منها أو إليها لتتبع عمليات النقل التي تم إكمالها. احتضان مجموعة من اثني عشر قارورة للأرشفة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ± 1 ساعة مع اهتزاز مداري 120 دورة في الدقيقة على قطر 1 بوصة جنبا إلى جنب مع ثقافات LTEE الاثني عشر والفراغ كما هو موضح في الخطوة 1.9. قم بإعداد الإمدادات لطلاء مجموعات LTEE قبل ساعة واحدة على الأقل من إجراء عمليات نقل LTEE في يوم التجميد.حدد اثني عشر MG واثني عشر MA واثني عشر لوحة أجار TA. افحص كل واحد بصريا للتأكد من عدم وجود أي تلوث واضح. قم بتسمية واحدة من كل نوع من أنواع الألواح لكل مجموعة من مجموعات LTEE الاثني عشر (A − 1 إلى A + 6).ملاحظة: عند وضع العلامات على اللوحات ، اكتب على جوانب الجزء السفلي من طبق بتري. هذا مهم لعدم حجب المستعمرات عندما يريد المرء فحصها أو تصويرها من أسفل أجار. لا تكتب على الأغطية ، حيث يمكن خلطها. ضع ألواح الآجار في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لتسخينها قبل استخدامها في الخطوة 2.10. تحضير ٢٤ أنبوب اختبار تحتوي على ٩٫٩ مل من محلول ملحي. رتبها في اثنتي عشرة مجموعة من أنبوبين لكل منهما. قم بتسمية كل مجموعتين من اثني عشر أنبوب اختبار بنفس طريقة اللوحات ، مع إضافة “1” أو “2” أسفل معرف مجتمع LTEE لتعيين الترتيب الذي سيتم استخدامه به لإجراء تخفيفات لتلك المجموعة. قم بتنفيذ الخطوات من 1.1 إلى 1.11 باستخدام القوارير التي ستستمر في عمليات النقل اليومية ل LTEE كالمعتاد. خلال الخطوة 1.5 ، قم أيضا بإزالة القوارير الاثني عشر التي تحتوي على الثقافات الإضافية للأرشفة من حاضنة الاهتزاز. ماصة 100 ميكرولتر من المستنبتة من كل من القوارير الاثني عشر الإضافية للأرشفة في أنبوب الاختبار الأول من المحلول الملحي في الزوج لسكان LTEE. دوامة الأنابيب مع هذه التخفيفات 100 أضعاف تماما. ثم ، ماصة 100 ميكرولتر من كل واحد إلى الأنبوب الثاني المقابل من المياه المالحة. دوامة التخفيفات الثقافية النهائية 10000 ضعف تماما. ماصة 80 ميكرولتر من كل أنبوب يحتوي على تخفيف ثقافة 10000 ضعف لألواح TA و MG و MA المسماة لتلك المجموعة. انشر السائل بشكل موحد عبر سطح الآجار باستخدام إما قضيب نشر معقم أو خرز نشر معقم ، حسب الرغبة. كرر حتى يتم طلاء جميع السكان الاثني عشر على جميع أنواع الوسائط الثلاثة. إذا لزم الأمر ، اترك الألواح تجف حتى لا يظهر سائل على الأجار. ضع الألواح رأسا على عقب (مع جانب الآجار لأعلى) في حاضنة الحمل الحراري للجاذبية مضبوطة على 37 درجة مئوية.ملاحظة: ألواح الحضانة رأسا على عقب تمنع الآجار من الجفاف وتمنع التكثيف من التنقيط على سطح الآجار. يمكن أن تؤدي حركة الخلايا في السائل على سطح الآجار أثناء الحضانة إلى تشويه المستعمرات وإنتاج عدد غير صحيح من المستعمرات. أضف 3 مل من الجلسرين المعقم بنسبة 80٪ (v / v) إلى كل من القوارير الاثني عشر الإضافية المخصصة للأرشفة. تخلط جيدا عن طريق الدوران والدوران بلطف. قم بتوزيع الخليط من كل قارورة على كريوفيالات معقمة تم تمييزها بمعرف فريد للعينة ، ومجموعة LTEE التي تنتمي إليها العينة ، والجيل الذي تم تجميدها فيه ، وأنها عينة مختلطة (سكانية) ، والتاريخ. ماصة 6 مل في قنينة واحدة كبيرة و 1.25 مل في كل من ست قوارير صغيرة.ملاحظة: القارورة الكبيرة هي مخزون العمل. قارورة واحدة صغيرة هي نسخة احتياطية في حالة استنفاد مخزون العمل أو تلوثه. القوارير الخمس الصغيرة الأخرى هي نسخ يمكن إرسالها إلى مختبرات أخرى. تجمد القوارير المملوءة عند -80 درجة مئوية. فحص وتوثيق نمو وأشكال المستعمرات على لوحات TA و MG و MA بعد 24 ساعة و 48 ساعة من الحضانة.ملاحظة: راجع قسم النتائج التمثيلية للحصول على صور وأوصاف المستعمرات التي شكلها أسلاف REL606 و REL607 وكل من مجموعات LTEE الاثني عشر عندما تم تصنيفها في 76000 جيل. اختياري: قم بتنفيذ الخطوات التالية عند أرشفة العزلات النسيلية.اختر ثلاث عزلات نسيلية (مستعمرات) لكل مجموعة LTEE من لوحات MG ، وقم بخط كل واحدة على حدة على لوحة MG جديدة ، واحتضن هذه الألواح لمدة 16-24 ساعة عند 37 درجة مئوية.ملاحظة: في حالة وجود مستعمرات ذات أشكال مختلفة ، فإن الممارسة القياسية في LTEE هي أخذ عينات لتحقيق أقصى قدر من التنوع عن طريق اختيار النوع الأكثر شيوعا أولا ، ثم اختيار مستعمرات أخرى من أنواع الأقليات. يمكن للمرء أيضا استخدام استراتيجية أخذ العينات العشوائية عن طريق وضع علامات على النقاط على الجانب السفلي من الجزء السفلي من طبق بتري قبل نشر الخلايا ثم اختيار المستعمرة المعزولة الأقرب إلى كل علامة بعد النمو. في اليوم التالي ، قم بخط مستعمرة تمثيلية من كل لوحة على لوحة MG جديدة واحتضان هذه الألواح لمدة 16-24 ساعة عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتلقيح مستعمرة معزولة واحدة من كل صفيحة MG في قارورة تحتوي على 10 مل من DM1000 الطازج. أيضا ، املأ قارورة إضافية ب 10 مل من DM1000 لتكون بمثابة فراغ غير ملقح لاختبار تلوث الوسائط. احتضان القوارير عند 37 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة مع اهتزاز مداري 120 دورة في الدقيقة على قطر 1 بوصة. بعد الحضانة ، أضف 2 مل من الجلسرين المعقم 80٪ (v / v) إلى كل قارورة ودوامة للخلط. قم بتوزيع حصص 1.25 مل من كل قارورة في قوارير صغيرة معقمة تحمل معرفا فريدا لكل نسخة ، وعدد LTEE وجيل المنشأ ، وأنها عينة نسيلية ، والتاريخ. تجمد القوارير المملوءة عند -80 درجة مئوية. 3. مقايسات اللياقة البدنية التنافسية ملاحظة: في LTEE ، يتم قياس اللياقة الإنجابية من حيث العدد النسبي للمضاعفة التي تحققها البكتيريا المختلفة على مدار دورة استزراع واحدة أو أكثر من 24 ساعة في ظل نفس ظروف التحويلات اليومية. على وجه التحديد ، فإن اللياقة النسبية لمنافس إلى آخر هي نسبة معدلات المضاعفة المحققة عندما يتنافسون وجها لوجه في ثقافة مشتركة. قد يكون كل منافس في الزوج مجموعة كاملة أو معزولة نسيلية تم أرشفتها مسبقا كجزء من “السجل الأحفوري” المجمد ل LTEE. بدلا من ذلك ، قد يكون أحد المنافسين أو كليهما استنساخا تم تعديله وراثيا لإضافة أو إزالة طفرات معينة لاختبار آثارها. يجب أن يكون لدى المتنافسين حالات Ara + / Ara− معاكسة لأن هذه العلامة الجينية تستخدم للتمييز بينهما أثناء هذا الفحص. يظهر سير العمل العام لمقايسة المنافسة في الشكل 2. يمكن تمديد مدة مرحلة الزراعة المشتركة من يوم إلى ثلاثة أيام (أو أكثر) لتحسين دقة تقديرات اللياقة عند اختبار الاختلافات بين المنافسين المتطابقة بالتساوي تقريبا. انظر Disussion للاطلاع على اعتبارات حاسمة أخرى وتعديلات محتملة على هذا البروتوكول. الشكل 2: مخطط انسيابي لمقايسة المنافسة. يتم عرض الإجراء الكامل لفحص المنافسة ليوم واحد. يستمر الإجراء لمدة ثلاثة أيام مع المسار البديل في اليوم 1 واليوم 2 حتى الطلاء في اليوم 3 بنفس الطريقة التي تم تصويرها لليوم 1 من مسابقة اليوم الواحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تحضير المستلزماتحدد عدد سلالات LTEE المنافسة و / أو المجموعات السكانية التي سيتم استخدامها وعدد فحوصات المنافسة المكررة التي سيتم إجراؤها لكل زوج من المنافسين. قم بإعداد المستلزمات اللازمة كما هو موضح في الخطوات التالية.ملاحظة: تتوفر وصفات لجميع الوسائط والحلول عبر الإنترنت30. يمكن ملء القوارير وأنابيب الاختبار المطلوبة لجميع أيام تجربة المنافسة مسبقا أو حسب الحاجة في الأيام التي سيتم استخدامها فيها. إذا تم ملء القوارير وأنابيب الاختبار في وقت مبكر ، فقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لتقليل التبخر. يجب تحضير ألواح TA قبل يومين على الأقل من موعد استخدامها حتى تجف بدرجة كافية بعد سكبها للسماح بنشر التخفيفات المستزرعة. قم دائما بإعداد عدد قليل من القوارير الإضافية وأنابيب الاختبار وألواح TA بحيث يمكن أن تستمر التجربة إذا كانت هناك أخطاء في السحب أو ألواح ملوثة أو حوادث طفيفة أخرى. بالنسبة ليوم الإحياء (اليوم −2) ، املأ دورق Erlenmeyer معقم سعة 50 مل مغطى بدورق سعة 20 مل مع 9.9 مل من DM1000 أو Lysogeny Broth (LB) لكل سلالة أو مجموعة من الإشريكية القولونية التي سيتم استخدامها كمنافس. املأ دورقا آخر ب 9.9 مل من نفس الوسط لتكون بمثابة فراغ غير ملقح. بالنسبة ليوم التهيئة المسبقة (اليوم -1) ، املأ أنبوب اختبار واحد ب 9.9 مل من محلول ملحي معقم بنسبة 0.85٪ (وزن / حجم) لكل منافس ، وقارورتين مع 9.9 مل من DM25 لكل مقايسة مكررة بين زوج من المنافسين ، وقارورة أخرى مع 9.9 مل من DM25 للفراغ. بالنسبة لليوم الذي تبدأ فيه المسابقة (اليوم 0) ، املأ قارورة واحدة ب 9.9 مل من DM25 ، املأ أنبوب اختبار واحدا ب 9.9 مل من محلول ملحي معقم بنسبة 0.85٪ (وزن / حجم) ، وقم بإعداد لوحة TA واحدة لكل تكرار لمقايسة المنافسة. املأ دورقا آخر ب 9.9 mL من DM25 لتكون فارغة. البديل: لكل يوم من أيام المنافسة متعددة الأيام بعد الأول ، املأ قارورة واحدة ب 9.9 مل DM25 لكل مسابقة مكررة واملأ قارورة أخرى ب 9.9 مل من DM25 للفراغ. في اليوم الأخير من المسابقة (على سبيل المثال ، اليوم 1 أو اليوم 3) ، املأ أنبوبي اختبار ب 9.9 مل من محلول ملحي معقم بنسبة 0.85٪ (وزن / حجم) وقم بإعداد لوحة TA واحدة لكل تكرار للمسابقة. اليوم −2: إحياء المنافسين بشكل منفصل في DM1000 أو LBلكل من المنافسين ، قم بتسمية دورق مملوء ب 9.9 مل من DM1000 أو LB. قم بتسمية دورق إضافي مملوء ب 9.9 مل من نفس الدفعة من الوسط ليكون بمثابة فراغ غير ملقح لاختبار التلوث.ملاحظة: يتم إحياء المخزونات المجمدة في LB أو DM1000 لاستعادة أكثر اتساقا ويمكن التنبؤ بها للخلايا المحفوظة بالتبريد. يمكن استقلاب الجلسرين المستخدم كواقي للتبريد بواسطة الإشريكية القولونية ، مما سيؤدي إلى كثافة خلايا أعلى من المتوقع إذا تم إحياء العينات في DM25. يدعم LB و DM1000 النمو إلى كثافات الخلايا العالية بحيث تصبح هذه المضاعفات ضئيلة. خذ المبردات التي تحتوي على المخزونات المجمدة من سلالات المنافسين من الفريزر -80 درجة مئوية. احتفظ بالقوارير مبردة في دلو ثلج أثناء استخدامها. بعد ذوبان كل مخزون مجمد ، قم بدوامة تماما لإعادة تعليق خلايا الإشريكية القولونية . في حالة إحياء نسخة ، قم بتلقيح القارورة التي تحتوي على وسط طازج ب 12 ميكرولتر من المخزون المجمد. في حالة إحياء السكان ، قم بتلقيح القارورة ب 120 ميكرولتر من المخزون المجمد.ملاحظة: يتم استخدام حجم 120 ميكرولتر من المخزون المجمد للسكان بحيث يكون عدد الخلايا التي يتم إحياؤها هو تقريبا نفس عنق الزجاجة اليومي عندما يتم نقل 1٪ من سكان LTEE إلى قارورة جديدة. يمكن أن يؤدي ذوبان الأرصدة المجمدة ودوامها عدة مرات إلى إجهاد الخلايا وتقليل صلاحية المخزونات بمرور الوقت. إذا كان سيتم استخدام مجموعة معينة من LTEE أو استنساخ في المسابقات عدة مرات ، فمن الممارسات الجيدة إعادة نمو وتجميد نسخ متعددة من المخزون بحيث لا يتم إذابة أي منها وإعادة تجميدها عدة مرات. احتضان قوارير الإحياء والفراغ عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (16-24 ساعة) مع اهتزاز مداري 120 دورة في الدقيقة على قطر 1 بوصة. اليوم −1: الاشتراط المسبق للمنافسين بشكل منفصل في DM25لكل منافس ، قم بتسمية أنبوب اختبار مملوء ب 9.9 مل من المحلول الملحي. لكل اختبار منافسة مكرر بين زوج من المنافسين ، قم بتسمية قارورتين سعة 50 مل مملوءة ب 9.9 مل من DM25 ، ولكل منهما رقم النسخ واسم أحد المنافسين. ضع علامة على دورق إضافي مملوء ب 9.9 مل من DM25 ليكون بمثابة فراغ. أخرج القوارير التي تحتوي على ثقافات المنافسين الذين تم إحياؤهم من الحاضنة. افحص تعكارها بالعين للتأكد من نموها وأنه لا يوجد تلوث واضح. ماصة 100 ميكرولتر من كل قارورة في أنبوب اختبار المياه المالحة لهذا المنافس.ملاحظة: تخفف هذه الخطوة المزرعة بمقدار 100 ضعف، وهو أمر ضروري لأن كثافة الخلايا أعلى بكثير في LB وDM1000 مما هي عليه في بيئة DM25 المستخدمة في LTEE (انظر النتائج التمثيلية). دوامة كل أنبوب تخفيف جيدا قبل سحب 100 ميكرولتر من الثقافة المخففة إلى قارورة مع DM25 الطازجة. قم بتلقيح اثنين من قوارير التكييف المسبق هذه لكل مقايسة مكررة ، واحدة لكل من المنافسين. احتضان قوارير التكييف المسبق والفراغ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ± 1 ساعة مع اهتزاز مداري 120 دورة في الدقيقة على قطر 1 بوصة. اليوم 0: ابدأ المنافسة عن طريق مزج المنافسين واللوحة للعد الأوليلكل تكرار لمقايسة المنافسة ، قم بتسمية قارورة واحدة مملوءة ب 9.9 مل من DM25 وأنبوب اختبار واحد مملوء ب 9.9 مل من المحلول الملحي. قم بتسمية القوارير والأنابيب بطريقة تحدد بشكل فريد كل زوج من المنافسين والرقم المتماثل لمقايسة المنافسة. ضع علامة على دورق إضافي مملوء ب 9.9 مل من DM25 ليكون بمثابة فراغ. أخرج قوارير التكييف المسبق من الحاضنة. افحص تعكارها بالعين للتأكد من نموها وأنه لا يوجد تلوث واضح. قم بنقل 50 ميكرولتر من منافس Ara− إلى أول دورق منافسة مكرر مملوء ب DM25 جديد. على الفور ، انقل 50 ميكرولتر من منافس Ara+ إلى نفس دورق المنافسة واخلطها عن طريق الدوران برفق. كرر الخطوة 3.4.3 لجميع النسخ المتماثلة لجميع أزواج المنافسين.ملاحظة: تحتوي قوارير المنافسة الآن على تخفيف إجمالي بمقدار 100 ضعف لمزارع الإشريكية القولونية المزروعة في DM25 ، وهي نفس خلايا الحالة في تجربة LTEE بعد كل نقل يومي. ترتيب إجراء عمليات النقل والخلط مهم. أضف كلا المنافسين إلى كل قارورة على الفور واحدة تلو الأخرى حتى لا يبدأ أي منهما في النمو في الوسط الجديد. على سبيل المثال ، لا تضيف ثقافات Ara− إلى جميع قوارير المنافسة ثم ارجع وأضف جميع سلالات Ara+ . ماصة 100 ميكرولتر من كل دورق منافسة تم تلقيحه حديثا في أنبوب اختبار المحلول الملحي المسمى لمقايسة المنافسة هذه بحيث يحتوي كل من هذه الأنابيب على تخفيف إجمالي بمقدار 10000 ضعف من مزارع DM25 المشروطة مسبقا التي تم دمجها. ضع قوارير المنافسة وفارغة في حاضنة الاهتزاز. احتضان قوارير المنافسة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ± 1 ساعة مع اهتزاز مداري 120 دورة في الدقيقة على قطر 1 بوصة. في نفس اليوم ، مباشرة بعد وضع قوارير المنافسة في الحاضنة ، دوامة كل أنبوب اختبار من الخطوة 3.4.5 تماما ونشر 80 ميكرولتر من هذه التخفيفات 10000 ضعف على لوحات TA كما هو موضح في الخطوة 2.10. قم بتسمية جانب الجزء السفلي من كل لوحة بزوج السلالات التي تم خلطها ، والرقم المتماثل ، و “اليوم 0” للإشارة إلى أنه سيتم استخدامه لتحديد التمثيل الأولي لكل منافس. احتضان لوحات TA رأسا على عقب في حاضنة الحمل الحراري للجاذبية عند 37 درجة مئوية حتى تصبح مستعمرات كل من منافسي Ara− و Ara + مرئية ويمكن تمييزها. بشكل عام ، يحدث هذا في غضون 16-24 ساعة ، ولكن قد يستغرق وقتا أطول لبعض السلالات المتطورة. احسب أعداد مستعمرات Ara− (الحمراء) وAra+ (البيضاء) على كل لوحة وسجل النتائج.ملاحظة: تصبح الاختلافات بين ألوان مستعمرات Ara- و Ara+ على ألواح TA أقل وضوحا بمرور الوقت ، حتى عندما يتم تخزين الألواح عند 4 درجات مئوية ، لذلك يجب عدها في أسرع وقت ممكن بمجرد إزالتها من الحاضنة. يتم تضمين صور لوحات TA التي تظهر المظاهر النموذجية للمستعمرات التي شكلتها خلايا Ara− و Ara + في النتائج التمثيلية. يحتوي هذا القسم أيضا على صور لمستعمرات “حالة الحافة” الشائعة (على سبيل المثال ، تداخل أو نمو أنواع مختلفة من المستعمرات) ، ويشرح كيفية عدها. إذا لم يتم تمييز معدلات نمو وأشكال المستعمرات التي تشكلت على ألواح TA من قبل أي من المنافسين من قبل ، فقم بنشر 80 ميكرولتر من تخفيف 10000 ضعف في محلول ملحي من قوارير التكييف المسبق في اليوم 0 ، عندما لا يزال المتنافسون منفصلين عن بعضهم البعض. ثم افحص المستعمرات على لوحات التحكم هذه بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة أو أكثر. البديل: اليومين 1 و 2: مواصلة المنافسة لمدة ثلاثة أياملكل تكرار لمقايسة المنافسة ، قم بتسمية قارورة واحدة مملوءة ب 9.9 مل من DM25. قم بتسمية القوارير بطريقة تحدد بشكل فريد كل زوج من المنافسين ، والرقم المتماثل ، ويوم فحص المنافسة. ضع علامة على دورق إضافي مملوء ب 9.9 مل من DM25 ليكون بمثابة فراغ. خذ قوارير المنافسة من اليوم السابق خارج الحاضنة. فحص تعكرها بالعين للتحقق من النمو المتوقع واكتشاف التلوث. انقل 100 ميكرولتر من كل قارورة منافسة إلى القارورة المقابلة للوسط الطازج لليوم التالي من المسابقة. ضع قوارير المنافسة الجديدة وفارغة في حاضنة الاهتزاز. احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ± 1 ساعة مع اهتزاز مداري 120 دورة في الدقيقة على قطر 1 بوصة. كرر الخطوات 3.5.1 إلى 3.5.4 في اليوم الثاني من المسابقة قبل المتابعة. اليوم 1 أو 3: إنهاء المنافسة واللوحة للعد النهائيلكل قارورة منافسة ، قم بإعداد أنبوبي اختبار مملوءين ب 9.9 مل من المياه المالحة. قم بتسميتها بطريقة تحدد بشكل فريد كل زوج من المنافسين ، والرقم المتماثل ، وما إذا كانت للتخفيف الأول أو الثاني. خذ قوارير المنافسة من الحاضنة. افحص تعكارتها بالعين لاكتشاف نموها وعدم وجود تلوث واضح. ماصة 100 ميكرولتر من كل قارورة منافسة في الأنبوب الأول من المحلول الملحي لهذا التكرار. تحتوي الأنابيب الناتجة على تخفيفات 100 ضعف لثقافات DM25. دوامة كل أنبوب تخفيف 100 أضعاف لخلطه جيدا وماصة 100 ميكرولتر إلى الأنبوب الثاني من المحلول الملحي لهذا التكرار. تحتوي الأنابيب الناتجة على تخفيفات 10000 ضعف من ثقافات DM25. دوامة كل أنبوب اختبار يحتوي على تخفيف 10000 ضعف تماما ونشر 80 ميكرولتر منه على لوحة TA كما هو موضح في الخطوة 2.10. قم بتسمية جانب الجزء السفلي من كل لوحة بزوج السلالات التي تم خلطها ، والرقم المتماثل ، و “اليوم 1” لمسابقة ليوم واحد أو “اليوم 3” لمسابقة مدتها ثلاثة أيام للإشارة إلى أنه سيتم استخدامه لتحديد التمثيل النهائي لكل منافس. احتضان ألواح TA عند 37 درجة مئوية وعد مستعمرات Ara− و Ara + بعد النمو كما هو موضح في الخطوة 3.4.8.ملاحظة: تتبع الرقم المتماثل لكل اختبار مسابقة خلال جميع عمليات النقل وخطوات الطلاء. سيؤدي الخلط بين الأعداد النهائية والأولية التي تتوافق بين المقايسات المكررة المختلفة – حتى عندما يتم خلط نفس المتنافسين في كل واحد – إلى تقديرات لياقة غير صحيحة. حساب ومؤامرة اللياقة البدنيةإذا كنت تستخدم Excel لحساب اللياقة النسبية وتخطيطها، فقم بتنزيل جدول بيانات XLS (الملف التكميلي 1). إذا كنت تستخدم R ، فقم بتثبيت حزمة fitnessR31 وقم بتنزيل قالب القيم المفصولة بفواصل (CSV) (الملف التكميلي 2) أو قم بإنشاء نسخة جديدة من هذا الملف باتباع الإرشادات الموجودة في المقالة القصيرة الخاصة به. أدخل “تخفيف النقل” 100 لفحوصات المنافسة التي أجريت في الخلية أو العمود المعين في الملف الذي تم تنزيله. أدخل العدد الإجمالي لدورات النمو اليومية التي تم خلالها استزراع المتنافسين على أنها “عدد التحويلات” (على سبيل المثال ، 3 لمسابقة مدتها ثلاثة أيام). أدخل أسماء كل زوج من المنافسين في الخلايا أو الأعمدة المعينة مع السلالة المرجعية ك “competitor1” وسلالة الاختبار أو السكان ك “competitor2”. لكل نسخة متماثلة لمقايسة المنافسة ، أدخل عدد المستعمرات الأولية والنهائية المعنية في الأعمدة المعينة للملف الذي تم تنزيله. إذا كنت تستخدم جدول بيانات Excel ، فسيعرض الآن متوسط قيمة اللياقة النسبية وحدود الثقة بنسبة 95٪ في هذا التقدير. انسخ النتائج لمجموعات مختلفة من المنافسين إلى ورقة أخرى وأنشئ مخططا يلخص النتائج. إذا كنت تستخدم R لتحليل البيانات ، فاتبع الإرشادات الموجودة في المقالة القصيرة لحزمة fitnessR لإجراء هذه العمليات الحسابية ، وإخراج ملف CSV بالقيم المحسوبة ، ورسم النتائج.

Representative Results

ظهور وتعكر ثقافات LTEEنظرا لانخفاض تركيز الجلوكوز في DM25 ، فإن تعكر مجموعات LTEE كاملة النمو بالكاد يمكن رؤيته في أحد عشر قارورة من أصل اثني عشر. عند فحص مزارع LTEE بالعين للنمو الطبيعي وعلامات التلوث (الخطوة 1.6) ، يجب مقارنة كل قارورة تحتوي على مجموعة LTEE جنبا إلى جنب مع الفراغ (الشكل 3 أ). الاستثناء هو السكان A−3 ، الذين تطوروا لاستخدام السيترات كمصدر إضافي للكربون والطاقة ، وبالتالي يصلون إلى كثافة خلية أعلى32. إن تعكر مزارع DM25 لسلالات أسلاف REL606 و REL607 مشابه لتعكر السكان المتطورين النموذجيين (الشكل 3 ب). تنمو سلالات LTEE وأعدادها إلى كثافة أعلى في DM1000 بسبب ارتفاع تركيز الجلوكوز ، وكثافة أعلى بكثير في LB (الشكل 3B). كثافة مزارع DM25 لسكان A−3 LTEE متوسطة بين كثافات مزارع REL606 في DM25 و DM1000 (الشكل 3C). الشكل 3: ظهور ثقافات LTEE. (أ) قوارير تحتوي على اثني عشر تجمعا LTEE بعد 24 ساعة من النمو في DM25 في اليوم الذي وصلت فيه التجربة إلى 76,253 1/3 أجيال مصورة بجانب الفراغ. (ب) تم تصوير قوارير تحتوي على ثقافات أسلاف REL606 و REL607 نمت لمدة 24 ساعة في DM25 و DM1000 و LB جنبا إلى جنب مع فراغات الوسائط. (ج) تكبير صور لنفس القوارير جنبا إلى جنب توضح كيف تقارن عكارة دورق A−3 في DM25 بسلف REL606 في DM25 و DM1000. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تتطابق قراءات مقياس الطيف الضوئي للكثافات البصرية عند 600 نانومتر (OD600) للمزارع المزروعة في DM25 (الخطوة 1.7) مع هذه الملاحظات المرئية لكل من مجموعات LTEE (الشكل 4A) وأسلافهم (الشكل 4B). يمكن استخدام هذه القراءات لمقارنة النمو وتوثيقه كميا عند الاشتباه في وجود تلوث أو خطأ. بالنسبة لقياسات مجموعات LTEE بين 76,000 و 76,500 جيل ، وجدنا أن OD600 من A −3 ، السكان الذين تطوروا للنمو على السيترات ، كان 0.223 في المتوسط (0.218-0.227 ، فاصل ثقة 95٪). كان OD600 من السكان الأحد عشر الآخرين 0.0252 في المتوسط (0.0239-0.0265 ، فاصل ثقة 95٪). كان هناك اختلاف طفيف ، ولكن كبير في قراءات OD600 بين السكان الأحد عشر الطبيعيين (F10,88 = 5.1035 ، p = 7.5×10−6). تصل مجموعات LTEE إلى مرحلة ثابتة بعد حوالي 5-6 ساعات من الحضانة. إذا تم نقلها في الصباح ، فسيكون النمو مرئيا بحلول منتصف إلى وقت متأخر بعد الظهر من نفس اليوم. العديد من أنواع الميكروبات قادرة على النمو هوائيا على السيترات. لذلك ، من المحتمل أن تكون زيادة التعكر في مجموعات أخرى غير A − 3 علامة على التلوث الخارجي. الشكل 4: تعكر ثقافات LTEE. (أ) الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) من مجموعات LTEE الاثني عشر بعد دورة النمو 24 ساعة في ثلاثة أيام مختلفة بين 76000 و 76500 جيل من التجربة. يتم رسم قيم OD600 لثلاث حصص 1 مل في كل يوم من الأيام الثلاثة المختلفة كنقاط. تم طرح متوسط قيمة OD600 لثلاث حصص مختلفة من الفراغ من نفس اليوم من هذه القيم. تظهر الأشرطة المملوءة المتوسطات. أشرطة الخطأ هي حدود ثقة بنسبة 95٪. (ب) OD600 من ثقافات أسلاف REL606 و REL607 في DM25 و DM1000 و LB. يتم رسم قيم OD600 لثلاث حصص 1 مل في كل يوم من ثلاثة أيام مختلفة لثقافتين منفصلتين لكل حالة وسلالة كنقاط. تم طرح متوسط قيمة OD600 لثلاث حصص مختلفة من الفراغ من نفس اليوم من هذه القيم. تظهر الأشرطة المملوءة المتوسطات وأشرطة الخطأ هي حدود ثقة بنسبة 95٪. تظهر المناطق المظللة باللون الرمادي بين اللوحات كيفية إعادة قياس محور OD600 بين لوحة DM25 ولوحات DM1000 و LB. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. نمو ومورفولوجيا مستعمرات LTEEعند فحص السكان بحثا عن التلوث عن طريق طلائهم على وسائط مختلفة (الخطوة 2.15) ، فإن أسلاف REL606 و REL607 وجميع المجموعات السكانية المتطورة تشكل مستعمرات بيضاء ذات حواف شفافة وغير منتظمة إلى حد ما على ألواح أجار الجلوكوز (MG) الدنيا (الشكل 5 أ). تكوين MG agar هو نفس تكوين DM25 المستخدم في عمليات نقل LTEE اليومية ، باستثناء تركيز أعلى من الجلوكوز ، لذلك غالبا ما تشكل مجموعات LTEE المتطورة مستعمرات أكبر على MG من الأسلاف. نظرا لارتفاع كثافة الخلايا في DM25 ، سيكون لدى السكان A − 3 عدة أضعاف أكثر من المستعمرات إذا تم طلاء نفس الحجم لها كما هو الحال بالنسبة للسكان الآخرين ، وهذا قد يحد من حجم المستعمرات. تشكل الأنواع الأكثر شيوعا من الميكروبات الملوثة مستعمرات بيضاء صارخة وغير شفافة ودائرية تماما على MG. على أجار أرابينوز الأدنى (MA) ، عادة ما يشكل سلف REL607 وسكان Ara + مستعمرات بيضاء شفافة قليلا. استمر نمط النمو النموذجي هذا لسكان آرا + خلال 76000 جيل ، باستثناء A + 6 ، الذي طور عيبا في النمو على أرابينوز ولم يعد يشكل مستعمرات على MA (الشكل 5B). لا يوجد اختيار للحفاظ على النمو على أرابينوز أثناء عمليات نقل LTEE في DM25 ، لذلك قد تتوقف مجموعات Ara + الأخرى في النهاية عن تكوين مستعمرات على ألواح أجار MA مع استمرار التجربة. باستثناء A−3 ، لا تشكل مجموعات Ara− مستعمرات على MA agar ، على الرغم من أن الفحص الدقيق قد يكشف عن مستعمرات صغيرة بسبب العناصر الغذائية النزرة في أجار. يشكل سكان A−3 العديد من المستعمرات الصغيرة على MA ، حيث يمكن أن تنمو هذه الخلايا على السيترات الموجودة أيضا في هذا الوسط. مستعمرات الملوثات على MA نادرة. الشكل 5: طلاء مجموعات LTEE للكشف عن التلوث. تم طلاء تخفيفات أسلاف REL606 و REL607 ومجموعات LTEE الاثني عشر في اليوم الذي وصلت فيه التجربة إلى 76026 2/3 أجيال على (A) MG و (B) MA و (C) TA أجار لوحات وتصويرها بعد 24 ساعة و 48 ساعة. تم إجراء نفس التخفيفات لجميع الثقافات ، ولكن تم طلاء نصف الحجم للأسلاف كما هو موضح في البروتوكول الخاص بمجموعات LTEE ، لحساب كثافة الخلايا العالية إلى حد ما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. على أجار رباعي أرابينوز (TA) ، من المتوقع أن يشكل سلف REL606 وجميع مجموعات Ara− مستعمرات حمراء ، بينما يجب أن يشكل سلف REL607 وجميع مجموعات Ara + بشكل عام مستعمرات بيضاء (والتي يمكن أن تشمل ظلال وردية فاتحة أو خوخية) (الشكل 5C). يشكل أسلاف LTEE مستعمرات قوية ، والتي يمكن التعرف عليها بسهولة على أنها Ara− و Ara + على TA agar في غضون 16-24 ساعة. في الأصل ، يمكن استخدام هذا الاختلاف للكشف عن التلوث المتبادل بين مجموعات Ara− و Ara + . ومع ذلك ، فإن TA agar له تركيبة مغذية أكثر تعقيدا من وسط DM25 المحدد كيميائيا المستخدم في عمليات النقل اليومية ، ولم يكن هناك ضغط تطوري على E. coli في LTEE للحفاظ على القدرة على النمو بقوة في ظل هذه الظروف. وبالتالي ، فإن بعض مجموعات LTEE المتطورة تظهر الآن نموا ضعيفا على ألواح TA ، حيث تستغرق 48 ساعة لتشكيل مستعمرات أو لا تنمو بشكل موثوق على الإطلاق. كما تغيرت ألوان وأشكال المستعمرات التي تشكلت على TA بواسطة مجموعات LTEE المتطورة بالنسبة للأسلاف وتباعدت عن بعضها البعض. إن وجود عدد قليل من المستعمرات الشاذة ليس دائما مؤشرا على التلوث. يمكن أن تحدث طفرات عفوية تؤدي إلى تبديل حالة علامة Ara لسلالات LTEE ، خاصة من Ara + إلى Ara− بسبب ارتفاع احتمالية حدوث طفرات فقدان الوظيفة التي تؤثر على استخدام أرابينوز مقابل طفرات الارتداد التي تستعيد نشاط araA. الطفرات التي تقوم بتبديل حالات علامة آرا أكثر شيوعا في المجموعات السكانية التي طورت طفرة مفرطة (A−1 و A−2 و A−3 و A−4 و A + 3 و A + 6)13. في TA agar ، غالبا ما تشكل الميكروبات الملوثة للأنواع الأخرى (ولكن ليس دائما) مستعمرات صغيرة دائرية تماما مع مراكز حمراء محاطة بحدود بيضاء مميزة تختلف عن تلك التي تشكلها أي سلالات أو مجموعات LTEE. نتائج مسابقة الثقافة المشتركةتظهر المسابقات بين جميع أزواج Ara− و Ara+ من أسلاف LTEE (REL606 و REL607 ، على التوالي) وعينات السكان A −5 و A + 5 المؤرشفة في 20000 جيل (REL8597 و REL8604 ، على التوالي) كيف يمكن تمييز المستعمرات ذات حالات علامات Ara المختلفة وحسابها على TA agar (الخطوتان 3.4.8 و 3.6.6) (الشكل 6). تم حساب المستعمرات لستة قوارير مكررة لكل زوج من المنافسين قبل وبعد فحوصات يوم واحد وثلاثة أيام بدأت بالإحياء في DM1000 (الجدول 1). تختلف الأعداد الإجمالية للمستعمرات التي لوحظت لنفس التخفيف والحجم المطلي بالمنافسين الذين اختلطوا لأن ثقافات مجموعات LTEE المتطورة تصل إلى كثافة خلايا أقل من مزارع سلالات الأسلاف في DM25. هذا الاختلاف هو نتيجة لتطور زيادة حجم الخلية ، والذي حدث في جميع مجموعات LTEE خلال الآلاف القليلة الأولى من الأجيال من التجربة 8,33. الشكل 6: مقايسات المنافسة مطلية على ألواح أجار TA. أمثلة على لوحات أجار TA من مقايسات المنافسة. REL606 و REL607 هما أسلاف Ara− و Ara+ من LTEE ، على التوالي. REL8597 و REL8604 هما 20000 جيل من السكان A − 5 و A + 5 ، على التوالي ، من “السجل الأحفوري” المجمد ل LTEE. يتم عرض لوحات TA المقابلة لمقايسة تكرار واحدة بين كل زوج من السلالات لليوم 0 واليوم 1 واليوم 3 من المنافسة. تم تصوير الصفائح بعد 24 ساعة من النمو عند 37 درجة مئوية. خلايا منافسي REL606 و REL8597 هي Ara− وتشكل مستعمرات حمراء. خلايا منافسي REL607 و REL8604 هي Ara + وتشكل مستعمرات بيضاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. ستكون معظم المستعمرات على لوحة TA النموذجية للمنافسة منفصلة جيدا أو متداخلة بطرق يسهل من خلالها حساب عدد المستعمرات الدائرية في البداية من أنواع مختلفة نمت معا (الشكل 7 أ). ومع ذلك ، قد تنشأ بعض المواقف التي ليس من الواضح فيها كيفية حساب مستعمرة غير نمطية أو نمو هو مزيج من اللونين. أولا ، عندما تتداخل مستعمرة Ara+ البيضاء ومستعمرة Ara− الحمراء ، تميل مستعمرة Ara+ إلى النمو الزائد وتغلف مستعمرة Ara-. في هذه الحالة ، يجب على المرء أن يحسب رقعة حمراء صغيرة أو “فجوة” شفافة في مستعمرة Ara + الأكبر كمستعمرة Ara− (الشكل 7B). ثانيا ، ستظهر طفرات Ara+ العفوية أحيانا في مستعمرات Ara-. تظهر هذه الطفرات عادة كقطاعات بيضاء (حليمات) تنتشر بسرعة أكبر خارج داخل مستعمرة حمراء لأنها تنمو بسرعة أكبر بمجرد وصولها إلى أرابينوز كمغذيات إضافية (الشكل 7 ج). يتم احتساب هذه المستعمرات ذات القطاع الأبيض كمستعمرة آرا واحدة ولا توجد مستعمرات آرا +. يصبح هذا الموقف أكثر شيوعا إذا تم تحضين الألواح لمدة 48 ساعة أو أكثر. ثالثا ، لوحظت مستعمرات وردية شفافة في بعض الأحيان (الشكل 7 د). يتم تشكيل هذه من قبل منافس آرا. أخيرا ، ينمو أحيانا عدد صغير من المستعمرات الدائرية ذات الأجزاء الداخلية ذات الظل الأحمر المختلف قليلا على ألواح TA عندما تكون ملوثة بعدد قليل من الخلايا الميكروبية الخارجية أثناء تحضير الآجار أو عند نشر التخفيفات الثقافية على أسطحها (الشكل 7E). لا ينبغي حساب هذه المستعمرات الملوثة. إذا اشتبه في تلوث ثقافة المنافسة بسبب وجود العديد من المستعمرات غير النمطية على أي من لوحات TA الخاصة بها ، فيجب استبعاد هذا التكرار. الشكل 7: حالات الحافة التي تمت مواجهتها عند حساب مستعمرات Ara− و Ara+ على TA agar. في كل لوحة ، يتم تمييز بعض مستعمرات Ara− و Ara+ التي يجب عدها بأسهم حمراء وسوداء صلبة ، على التوالي. يشار إلى المستعمرات التي لا ينبغي عدها بأسهم متقطعة تتوافق مع النوع الذي تبدو عليه. تم التقاط جميع الصور بعد 24 ساعة من الحضانة باستثناء اللوحة C. (A) أمثلة على مستعمرات Ara− و Ara + العادية. (ب) أمثلة على مستعمرات آرا + التي تنمو بالقرب من مستعمرات آرا ، بما في ذلك مستعمرة بالكاد يمكن رؤيتها كفجوة شفافة في الجزء الخارجي من المستعمرة البيضاء. عد كل حالة من هذه الحالات كمستعمرتين ، واحدة من كل نوع. (ج) أمثلة على مستعمرات آرا التي أدت إلى ظهور قطاعات آرا + الطافرة. عد كل حالة على أنها مستعمرة آرا واحدة فقط. القطاع الأبيض (الحليمة ) الذي ينشأ يرجع إلى متحولة آرا + الناشئة داخل المستعمرة. يظهر نفس حقل المستعمرات بعد 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة من النمو. د: مثال على مستعمرة وردية شفافة. احسبها ك Ara−. ه: أمثلة على المستعمرات التي تكونت بسبب التلوث الخارجي بواسطة ميكروب ليس الإشريكية القولونية. هذه حمراء ولكنها أصغر ودائرية تماما مع حدود بيضاء مميزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. يوضح تحليل أعداد المستعمرات من هذه المسابقات باستخدام جدول بيانات Excel (الملف التكميلي 1) أو عن طريق تشغيل وظائف حزمة fitnessR في R على أعداد المستعمرات التي تم إدخالها في قالب CSV (الملف التكميلي 2) أنه لا يمكن التمييز بين السلفين من حيث لياقتهما ضمن دقة الفحص ، وأن كلا من السكان من الجيل A −5 و A + 5 البالغ عددهم 20000 جيل أكثر ملاءمة بكثير من الأسلاف ، وأن أيا من السكان المتطورين ليس أكثر ملاءمة بكثير من الآخر (اختبارات ويلش t ، ص > 0.05) (الشكل 8). تتحسن دقة تقدير اللياقة النسبية في المسابقات التي تستغرق ثلاثة أيام مقابل مسابقات اليوم الواحد لأحد الأزواج المتطابقة بشكل وثيق (REL606 مقابل REL607). يمكن زيادة دقة هذه القياسات بشكل أكبر عن طريق إجراء مسابقات أطول مع المزيد من دورات النمو ، إذا رغبت في ذلك. ومع ذلك ، فإن نتائج المسابقات متعددة الأيام ليست مفيدة بمجرد أن يصبح أحد المنافسين وفيرا جدا بالنسبة للآخر بعد أيام المنافسة الإضافية بحيث لا يمكن تحديد نسبة السلالتين بدقة نظرا لوجود عدد قليل جدا من المستعمرات من النوع الأقل ملاءمة أو عدم احتسابها. هذا هو الحال بالنسبة لمسابقات الأسلاف التي استمرت ثلاثة أيام ضد 20000 جيل متطور (REL606 مقابل REL8604 و REL607 مقابل REL8597) (الشكل 6 والجدول 1). الجدول 1: عدد المستعمرات من فحوصات اللياقة البدنية التنافسية. تم إجراء فحوصات منافسة لمدة يوم واحد وثلاثة أيام مع ستة مكررات لجميع المجموعات الزوجية لاثنين من Ara− واثنين من منافسي Ara + . REL606 و REL607 هما أسلاف Ara− و Ara+ من LTEE ، على التوالي. REL8597 و REL8604 هما 20000 جيل من السكان A − 5 و A + 5 ، على التوالي ، من “السجل الأحفوري” المجمد ل LTEE. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول. الشكل 8: قياس اللياقة النسبية باستخدام مقايسات المنافسة. نتائج فحوصات المنافسة لمدة يوم وثلاثة أيام بين أسلاف LTEE و 20000 جيل من السكان A −5 و A + 5 LTEE. يوضح الشكل الموجود على اليسار المسابقات الزوجية الأربع في صورة أسهم مزدوجة الرأس مرمزة بالألوان. تم اختبار كل مجموعة من متنافسي Ara− (العلامات الحمراء) واثنين من Ara+ (العلامات السوداء) بتكرار ستة أضعاف. تم تحليل عدد المستعمرات من الجدول 1 في R باستخدام حزمة fitnessR31 ، وتم رسم النتائج باستخدام حزمة ggplot2 (الإصدار 3.4.0) 34. يتم عرض اللياقة البدنية على أنها المنافس الذي يتجه إليه السهم الموجود في الملصق بالنسبة إلى المنافس الذي يأتي منه السهم (على سبيل المثال ، REL8604 بالنسبة إلى REL606). يتم عرض قيم اللياقة النسبية المقدرة من أعداد المستعمرات لكل تكرار لمقايسة المنافسة (نقاط) ، ومتوسط قيم اللياقة النسبية لزوج المنافسين (أشرطة مملوءة بنفس الترميز اللوني مثل الرسم التخطيطي) ، وفترات ثقة 95٪ (أشرطة الخطأ). لا يمكن تحديد قيم اللياقة النسبية (N.D.) للمسابقات التي استمرت ثلاثة أيام بين الأسلاف والسكان المتطورين لأنه كان هناك صفر أو عدد قليل جدا من مستعمرات الأسلاف في لوحات اليوم 3 (انظر الجدول 1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الملف التكميلي 1. ملف جدول بيانات Excel لحساب اللياقة النسبية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 2. قالب ملف إدخال قيم مفصولة بفواصل لحساب اللياقة النسبية في R باستخدام حزمة fitnessR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

المرونة طويلة الأجل ل LTEE وأساليبها
تجربة التطور طويل الأجل للإشريكية القولونية (LTEE) هي الآن في عقدها الرابع. بالنسبة لتجربة التطور الميكروبي لأي مدة ، من الأهمية بمكان الحفاظ على بيئة قابلة للتكرار ، وتجنب التلوث ، وأرشفة العينات ، وقياس اللياقة بدقة. يوضح LTEE العديد من الاستراتيجيات التي تم اختبارها عبر الزمن لتحقيق هذه الأهداف ، بما في ذلك استخدام قوارير مهتزة جيدا تخلق بيئة متجانسة ووسط نمو محدد كيميائيا يدعم كثافة الخلايا المنخفضة. علاوة على ذلك ، يستخدم LTEE سلالات أسلاف تختلف في علامة جينية تعطي نمطا ظاهريا (لون مستعمرة) يسهل فحصه ومحايدا بشكل انتقائي في بيئة التطور. توفر ميزة التصميم التجريبي هذه وسيلة لتحديد التلوث الداخلي والخارجي وتسهل قياس اللياقة. ومع ذلك ، لم تثبت جميع الإجراءات والضمانات التي استخدمها LTEE منذ عام 1988 أنها قوية بنفس القدر. أصبحت بعض الطرق التي كانت موثوقة عندما بدأت LTEE أقل فعالية مع تطور مجموعات الإشريكية القولونية . لحسن الحظ ، يمكن الآن زيادة هذه الأساليب الإشكالية أو استبدالها باستخدام التقنيات التي تم تطويرها منذ بداية التجربة.

الكشف عن التلوث
يعد اكتشاف التلوث أمرا بالغ الأهمية ل LTEE. يمكن أن يكون التلوث من نوعين: بين مجموعات LTEE (التلوث المتبادل) ومع الميكروبات من البيئة (التلوث الخارجي). بالنسبة للجزء الأكبر ، فإن الاستخدام الدقيق لتقنيات التعقيم والاهتمام الوثيق أثناء إعداد الوسائط وعمليات النقل اليومية يمنع كلا النوعين من التلوث ، لكنهما يحدثان. في وقت مبكر من التجربة ، يمكن استخدام الطلاء على TA agar للكشف عن حالات التلوث المتبادل لأن عمليات النقل كانت دائما بالتناوب بين مجموعات Ara⁻ و Ara⁺. كان المقصود أيضا أن تكون بصمة حساسية ومقاومة هذه الإشريكية القولونية لبعض البكتيريا ميزة تصميم يمكن أن تميز مجموعات LTEE عن سلالات مختبر الإشريكية القولونية شائعة الاستخدام التي قد تلوثها⁴. ومع ذلك ، أصبحت هذه العلامات الجينية غير موثوقة مع تقدم التجربة (على سبيل المثال ، لم تعد بعض المجموعات السكانية تشكل مستعمرات على TA agar)^10,35. لحسن الحظ ، تباعدت المجموعات وراثيا لأنها شهدت تاريخا تطوريا منفصلا خلال التجربة ، مما أدى إلى إنشاء علامات جينية جديدة يمكن استخدامها الآن للكشف عن التلوث المتبادل. على سبيل المثال ، طور كل مجتمع مجموعة مجموعة فريدة من الطفرات في جينات pykF و nadR ¹⁴،^36،37. نقوم أحيانا بتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل سانجر هذين الجينين لاختبار ما إذا كانت المستعمرات ذات الأشكال أو الألوان غير العادية ناتجة عن التلوث المتبادل. مع استمرار انخفاض تكاليف الجينوم الكامل وتسلسل السكان بالكامل ، قد يكون التسلسل الروتيني لمجموعات LTEE ممكنا قريبا ، مما يوفر فرصا جديدة لمراقبتها بحثا عن علامات التلوث.

قياس اللياقة التنافسية
حالة أخرى تجاوزت فيها LTEE أساليبها الأصلية هي أن لياقة الإشريكية القولونية المتطورة قد زادت في البيئة التجريبية لدرجة أنه لم يعد بإمكان المرء قياس لياقة سكان اليوم بشكل مباشر بالنسبة لأسلافهم باستخدام البروتوكول الموصوف هنا. تتفوق المجموعات السكانية المتطورة على الأسلاف لدرجة أنه لم يتبق سوى عدد قليل من مستعمرات الأسلاف أو عدم عدمها بعد منافسة استمرت يوما واحدا. تتمثل إحدى طرق التعامل مع هذا الاختلاف الكبير في اللياقة في استخدام نسب بدء غير متساوية للسلالات ، وترجيح الأحجام الأولية المختلطة نحو المنافس الأقل ملاءمة (على سبيل المثال ، سلف 90 ميكرولتر ومنافس متطور 10 ميكرولتر). تتمثل الطريقة الثانية في تحديد استنساخ Ara⁻ المتطور الذي يتمتع بلياقة أعلى من سلف LTEE ، وعزل متحولة Ara ⁺ العفوية منه عن طريق الاختيار على MA agar ، ثم التحقق من أن سلالة العاكس لها نفس اللياقة مثل أصلها باستخدام اختبار المنافسة ^6,38. يمكن بعد ذلك استخدام زوج Ara⁻ / Ara ⁺ الجديد هذا كمجموعة من سلالات المنافسين الشائعة بدلا من REL606 / REL607. من الناحية المثالية ، سيكون لاستنساخ Ara⁻ المتطور الذي تم اختياره كمنافس مشترك (وعائده Ara⁺ ) لياقة متوسطة بالنسبة لجميع السلالات ذات الاهتمام في التجربة. على مدار أول 50000 جيل من LTEE ، لم ينتج هذان النهجان (باستخدام نسب بدء غير متكافئة أو منافس مشترك) قياسات لياقة مختلفة بشكل هادف مقابل النهج النموذجي³⁹.

هذه التعديلات على بروتوكول المنافسة تجعل بعض الافتراضات المبسطة التي قد لا تكون صحيحة دائما. الأول هو أن قياسات اللياقة البدنية متعدية. وهذا يعني أننا إذا تنافسنا بين مجموعتين سكانيتين مقابل سلالة منافسة مشتركة بشكل منفصل ، فيمكننا استنتاج اللياقة النسبية للمجموعتين لبعضهما البعض. تم العثور على هذه العلاقة لتكون صحيحة بالنسبة ل LTEE⁴⁰ ، بالنسبة للجزء الأكبر ، ولكنها ليست للتجارب الأخرى⁴¹. يمكن أن يكون أحد أسباب هذا التناقض هو تطور تأثيرات اللياقة البدنية السلبية المعتمدة على التردد. يحدث هذا الموقف عندما تتنافس سلالات معزولة من سلالتين مختلفتين متباعدتين من السكان A − 2 من LTEE ضد بعضها البعض^19,42. لكل منها ميزة عندما تكون نادرة ، بسبب التغذية المتقاطعة ، مما يستقر في تعايشها. تشير بيانات التسلسل التي تظهر تعايشا طويل الأمد للسلالات مع مجموعات مختلفة من الطفرات إلى أن تفاعلات مماثلة ربما نشأت أيضا في مجموعات LTEE الأخرى^14,43 ، على الرغم من أنه ليس من الواضح ما إذا كانت قوية بما يكفي لتغيير تقديرات اللياقة بشكل ملحوظ. أخيرا ، فإن تطور النمو الهوائي على السيترات في السكان A − 3 من LTEE³² يعني أن لياقة هذه الخلايا تتضمن الآن استخدام مورد “خاص” عندما يتم التنافس مع الخلايا التي لا يمكنها استخدام السيترات ، مما يعقد تفسير هذه النتائج. على الرغم من هذه الاستثناءات ، فإن استخدام تركيز منخفض للجلوكوز وبيئة مهتزة جيدا قد بسط بلا شك إجراء مقارنات للياقة البدنية بين سلالات LTEE والسكان.

في الأجيال اللاحقة ، لم تعد بعض مجموعات LTEE تشكل مستعمرات على TA agar ، مما يجعل إجراء تجارب المنافسة باستخدام حتى البروتوكولات المعدلة أمرا صعبا أو مستحيلا¹⁰. يمكن استخدام طرق بديلة لا تتطلب نمو مستعمرة لتحديد التمثيل النسبي لمنافسين ، مثل FREQ-seq الذي يستخدم تسلسل الجيل التالي لحساب نسبة القراءات التي تحتوي على أليلين بديلين في amplicon⁴⁴. يمكن استخدام هذه الطريقة أو طريقة مماثلة مع أليلات آرا أو مع الطفرات المتطورة حديثا ، مثل تلك الموجودة في pykF و nadR ، مقابل تسلسل الأسلاف. يمكن أيضا استخدام إجراء التعديلات الجينية التي تقدم أنواعا أخرى من العلامات المحايدة لقياس اللياقة النسبية. على سبيل المثال ، تم إدخال جينات البروتين الفلوري في كروموسومات الخلايا في تجارب فرع LTEE بحيث يمكن حساب المنافسين باستخدام قياس التدفق^{الخلوي 45}. هناك نهج آخر ، يفتح إمكانية خلط أكثر من سلالتين معا في نفس قارورة المنافسة ، وهو إدخال الرموز الشريطية التي يمكن تضخيمها وتسلسلها في جينومات المنافسين المختلفين. تم استخدام هذا النهج لتتبع النسب في تجارب التطور⁴⁶. يمكن لكل من قياس التدفق الخلوي وتسلسل الباركود أن يقيس بدقة النسب الأكثر تطرفا لسلالتين مقابل عد المستعمرات (لأنه يمكنهم الاستعلام عن > 10000 خلية / جينوم مقابل < 500 التي يمكن عدها على لوحة أجار) ، لذا فإن استخدام هذه الطرق يعد أيضا بزيادة النطاق الديناميكي من حيث اختلافات اللياقة التي يمكن قياسها بالنسبة إلى منافس مشترك.

تصاميم بديلة لتجارب التطور الميكروبي طويلة الأجل
على الرغم من كل فضائلها ، فإن LTEE ليست مثالية. بعض جوانب تصميمه تجعله كثيف العمالة وعرضة للخطأ البشري. على سبيل المثال ، يجب أن يأتي الباحث كل يوم إلى المختبر والماصة بين قوارير Erlenmeyer لمواصلة التجربة. يمكن أن تشكل تجارب المنافسة أيضا عقبات لوجستية شاقة ، بالنظر إلى أن متطلبات الأواني الزجاجية المعقمة ، والوسائط ، ومساحة الحاضنة ، وعد المستعمرات تتصاعد بسرعة عندما يتم اختبار عدد صغير من المنافسين بتكرار متواضع. غالبا ما يسألنا لماذا لا نستفيد من أنظمة أتمتة المختبرات ، مثل روبوتات السحب التي تعمل على 96 صفيحة دقيقة ، أو أنظمة الاستزراع المستمر ، مثل chemostats أو turbidostats. الجواب بسيط: LTEE ، إلى حد ما ، سجين لتاريخه الطويل. لا نجرؤ على الانحراف عن ثقافات 10 مل تهتز بسرعة محددة في قوارير Erlenmeyer سعة 50 مل لأن هذا من شأنه أن يخاطر بتغيير التجربة بشكل جذري. سيتم تغيير الجوانب الدقيقة للبيئة التي كان هؤلاء السكان يتكيفون معها لعقود (على سبيل المثال ، كمية التهوية) في الصفائح الدقيقة أو أنظمة الاستزراع المستمر. قد يكون عنق الزجاجة السكاني في كل عملية نقل مختلفا أيضا (أصغر في الصفائح الدقيقة ، على سبيل المثال) ، مما يغير الديناميات التطورية. باختصار ، فإن الانحراف عن الأساليب الموضحة هنا من شأنه أن يجعل LTEE تجربة مختلفة ، أو على الأقل يخاطر بإدخال انقطاع من شأنه أن يعطل المسارات التطورية.

يجب على الباحثين الذين يصممون تجارب تطور جديدة النظر في هذه الطرق الأخرى لنشر المجموعات الميكروبية ، مع إدراك فوائدها وعيوبها المحتملة. يعد استخدام روبوتات السحب لنقل السكان في ألواح microwell أبسط من الناحية اللوجستية من بعض النواحي ويمكن أن يثبت أنه قوي جدا بسبب الأعداد الكبيرة من المجموعات المكررة التي يمكن نشرها بهذه الطريقة⁴⁷،^48،49. ومع ذلك ، فإن عمليات النقل الآلية في معظم الإعدادات الحالية لا تتم في ظل ظروف معقمة تماما ، مما يزيد من احتمال التلوث الخارجي. لمنع التلوث ، غالبا ما يتم استكمال وسط النمو بالمضادات الحيوية ، والتي تصبح سمة من سمات البيئة التي تؤثر على التطور. كما أن عمليات النقل في ألواح microwell أكثر عرضة لأحداث التلوث المتبادل. أخيرا ، تميل بيئة ألواح microwell – خاصة إذا لم تهتز – إلى اختيار نمو الجدار والتجميع والظواهر الأخرى التي يمكن أن تعقد التطور من خلال إنشاء منافذ متعددة في بئر واحدة. من المرجح أن يؤدي استخدام الوسائط الغنية أو التركيزات العالية من العناصر الغذائية للحفاظ على أحجام السكان الكبيرة في الآبار الصغيرة إلى تفاقم هذه التعقيدات. إذا ظهرت مثل هذه التفاعلات ، فإنها يمكن أن تجعل قياس وتفسير اللياقة البدنية أكثر صعوبة.

تشمل أنظمة الاستزراع المستمر للتطور الميكروبي chemostats ، حيث يتم ضخ وسط جديد باستمرار ويتم ضخ الثقافة ، و turbidostats ، حيث يتم تخفيف الثقافات بشكل دوري من خلال الاستشعار الآلي والضخ للحفاظ على الخلايا في حالة نمو مستمر. هذه الأنظمة مفيدة للغاية عندما يرغب المرء في نمذجة علم وظائف الأعضاء الميكروبية والتطور لأنها تتجنب انتقال الميكروبات بين النمو والمجاعة عن طريق الاحتفاظ بها في بيئة تحتوي دائما على العناصر الغذائية⁵⁰. يمكن للمرء حتى إضافة أجهزة استشعار تقوم بإجراء قياسات في الوقت الفعلي للكثافة البصرية ، واستهلاك O₂ ، ودرجة الحموضة ، والجوانب الأخرى لبيئة الثقافة ونموها. ومع ذلك ، تتطلب أنظمة الثقافة المستمرة الحالية إما شراء معدات باهظة الثمن أو خبرة متخصصة لبناء إعدادات مخصصة⁵¹،^52،53،54. كما أن نمو الجدار، الذي تفلت فيه الخلايا من التخفيف عن طريق الالتصاق بغرفة الثقافة، يفسد الديناميات التطورية في أنظمة الاستزراع المستمر ما لم يتم تعقيمها بشكل دوري. بسبب هذه القيود ، كانت معظم تجارب تطور chemostat و turbidostat حتى الآن محدودة المدة و / أو تضمنت عددا قليلا نسبيا من المجموعات المتطورة بشكل مستقل مقارنة بتجارب تطور النقل المتسلسل.

استنتاج
تعتبر الطرق التي نوضحها هنا ل LTEE ضرورية لدراسة سجلها التاريخي الفريد ومواصلة التطور المفتوح لمجموعات الإشريكية القولونية هذه. كما أنها توفر نقطة انطلاق للآخرين الذين يفكرون في تجارب تطور جديدة قد تستفيد من أتمتة المختبرات أو تضيف عناصر مختلفة من التعقيد الموجود في البيئات الطبيعية التي تم حذفها عمدا من LTEE. منذ عام 1988 ، ازدهر التطور التجريبي كمجال. خلال هذا الوقت ، أظهر الباحثون في المختبرات في جميع أنحاء العالم المرونة الهائلة لهذا النهج لدراسة التطور والابتكار من خلال تقديم تصميمات تجريبية إبداعية ومراقبة النتائج باستخدام تقنيات جديدة. لا تمثل أساليب LTEE نقطة نهاية ، لكننا نأمل أن تستمر في إلهام وتوفير أساس للمجال في المستقبل البعيد.

Materials

2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	T8877
20 mL Glass Beaker	Sigma-Aldrich	CLS100020
50 mL Erlenmeyer Flasks	Sigma-Aldrich	CLS498050
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ammonium Sulfate	Sigma-Aldrich	AX1385
Antifoam	Sigma-Aldrich	A5757
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Freezer Box (2")	VWR	82007-142
Freezer Box (3")	VWR	82007-144
Freezer Box Cell Divider (49-place)	VWR	82007-150
Freezer Box Cell Divider (81-place)	VWR	82007-154
Freezer Vials (1/2-Dram)	VWR	66009-816
Freezer Vials (2-Dram)	VWR	66010-560
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Metal Tray	Winco	SPJP-202
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875712
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate	Sigma-Aldrich	P5504
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	M7506
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate	Sigma-Aldrich	C7254
Test Tube Cap (18mm)	VWR	10200-142
Test Tube Rack (18mm, steel)	Adamas-Beta	N/A	Test Tube Racks Stainless Steel Grid Arrangement 72 Holes (17-19 mm)
Test Tubes (18 x 150 mm)	VWR	47729-583
Thiamine, Hydrochloride	Millipore	5871
Tryptone	Gibco	211705
Yeast Extract	Gibco	212750