Här presenterar vi ett protokoll för att generera tarmorganoider från råttor och använda dem i flera nedströmsapplikationer. Råttor är ofta en föredragen preklinisk modell, och det robusta tarmorganoidsystemet fyller behovet av ett in vitro-system för att åtfölja in vivo-studier .
När man använder organoider för att bedöma fysiologi och cellens öde är det viktigt att använda en modell som nära rekapitulerar in vivo-sammanhang . Följaktligen används patienthärledda organoider för sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och personlig behandlingsscreening. Mus tarmorganoider används ofta för att förstå aspekter av både tarmfunktion/fysiologi och stamcellsdynamik/ödesbeslut. Men i många sjukdomssammanhang är råttor ofta att föredra framför möss som modell på grund av deras större fysiologiska likhet med människor när det gäller sjukdomspatofysiologi. Råttmodellen har begränsats av brist på genetiska verktyg tillgängliga in vivo, och organoider från råttors tarmar har visat sig vara ömtåliga och svåra att odla på lång sikt. Här bygger vi vidare på tidigare publicerade protokoll för att på ett robust sätt generera tarmorganoider från råttor från tolvfingertarmen och jejunum. Vi ger en översikt över flera nedströmsapplikationer som använder tarmorganoider från råttor, inklusive funktionella svullnadsanalyser, helmonteringsfärgning, generering av 2D-enteroidmonolager och lentiviral transduktion. Råttorganoidmodellen ger en praktisk lösning på fältets behov av en in vitro-modell som behåller fysiologisk relevans för människor, snabbt kan manipuleras genetiskt och lätt erhålls utan de hinder som är involverade i att skaffa mänskliga tarmorganoider.
Den mänskliga tunntarmens epitelarkitektur och cellulära sammansättning är komplexa, vilket återspeglar deras fysiologiska funktioner. Tunntarmens primära roll är att absorbera näringsämnen från mat som passerar genom dess lumen1. För att maximera denna funktion är tarmytan organiserad i fingerliknande utsprång som kallas villi, som ökar den absorberande ytan, och koppliknande invaginationer som kallas kryptor, som rymmer och isolerar stamcellerna. Inom epitelet genereras olika specialiserade absorberande och sekretoriska celltyper för att utföra distinkta funktioner1. På grund av denna komplexitet har det varit svårt att modellera vävnader som tarmen i högpassagetransformerade immortaliserade cellinjer. Studien av stamceller, särskilt vuxna stamceller och deras differentieringsmekanismer, har dock möjliggjort utvecklingen av 3D-tarmorganoidkulturer. Användningen av organoidmodeller har förändrat fältet, delvis på grund av deras rekapitulation av vissa arkitektoniska komponenter och celltypsheterogenitet som finns i den intakta tarmen. Tarmorganoider kan odlas på lång sikt in vitro på grund av upprätthållandet av den aktiva stamcellspopulationen2.
Tarmorganoider har snabbt blivit en anpassningsbar modell för att studera stamcellsbiologi, cellfysiologi, genetiska sjukdomar och nutrition3,4, samt ett verktyg för att utveckla nya metoder för läkemedelstillförsel5. Dessutom används patienthärledda organoider för sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och personlig behandlingsscreening, bland annat 6,7,8,9. Mänskliga tarmorganoider utgör dock fortfarande utmaningar. Tillgången på vävnader, krav på godkännande från Institutional Review Board och etiska frågor begränsar den utbredda användningen av humanprover. Dessutom kräver mänskliga tarmorganoider som genereras från tarmkryptor två distinkta odlingsbetingelser för att upprätthålla odifferentierade stamceller eller för att inducera differentiering av mogna celltyper10. Detta står i kontrast till in vivo, där stamceller och mogna differentierade celltyper är närvarande samtidigt och kontinuerligt genereras/upprätthålls1. Å andra sidan kräver tarmorganoider från möss, som odlas i en mindre komplex cocktail av tillväxtfaktorer, inte denna förändring i mediesammansättningen och kan upprätthålla stamceller och differentierade celler i samma mediekontext 2,11. Viktiga skillnader i mustarm jämfört med människor kan dock göra musorganoider till en suboptimal modell i många fall. Sammantaget har många tarmorganoider från större däggdjur, inklusive hästar, grisar, får, kor, hundar och katter, framgångsrikt genererats i odlingsförhållanden som är närmare anpassade till mustarmsorganoider än odlingsförhållandena för mänskliga tarmorganoider12. Skillnaderna i tillväxtfaktorförhållanden mellan mus och humana organoider återspeglar sannolikt skillnader i stamcellsnischsammansättning och olika krav på stamcellers överlevnad, proliferation och underhåll. Därför finns det ett behov av ett lättillgängligt modellorganoidsystem som 1) liknar mänsklig tarmcellssammansättning, 2) innehåller stamceller med tillväxtfaktorkrav som de hos mänskliga tarmorganoider, och 3) kan kontinuerligt upprätthålla odifferentierade och differentierade fack. Helst skulle systemet vara från en vanligt förekommande preklinisk djurmodell, så att in vivo– och in vitro-experiment kan korreleras och användas tillsammans.
Råttor är en vanligt förekommande preklinisk modell för tarmfysiologi och farmakologiska studier på grund av deras mycket lika tarmfysiologi och biokemi som människor13, särskilt med avseende på tarmpermeabilitet14. Deras relativt större storlek jämfört med möss gör dem mer mottagliga för kirurgiska ingrepp. Även om modeller av stora djur, inklusive grisar, ibland används, är råttor en mer prisvärd modell, kräver mindre utrymme för djurhållning och har lätt kommersiellt tillgängliga standardstammar15. En nackdel med att använda råttmodeller är att den genetiska verktygslådan för in vivo-studier inte är välutvecklad jämfört med möss, och genereringen av nya råttlinjer, inklusive knockouts, knock-ins och transgena läkemedel, är ofta kostsam. Utvecklingen och optimeringen av en robust tarmorganoidmodell för råttor skulle möjliggöra genetisk manipulation, farmakologiska behandlingar och studier med högre genomströmning i en tillgänglig modell som behåller viktig fysiologisk relevans för människor. Fördelarna med en gnagarorganoidmodell jämfört med en annan är dock mycket beroende av den specifika process eller gen som studeras; Vissa gener som finns hos människor kan vara pseudogener hos möss men inte hos råttor16,17. Dessutom avslöjas artspecifika cellsubtyper i allt högre grad av encells-RNAseq18,19,20. Slutligen uppvisar modeller för tarmsjukdomar hos råttor och möss ofta betydande variationer i fenotyper21,22 så att den modell som närmare rekapitulerar symtomen och sjukdomsprocessen som ses hos människor måste väljas ut för nedströmsarbete. Genereringen av en tarmorganisationsmodell för råttor ger ytterligare flexibilitet och valmöjligheter för forskare att välja ett modellsystem som är mest lämpligt för deras omständigheter. Här utökas befintliga protokoll23,24 för generering av råtttarmorganoider och ett protokoll beskrivs för generering och underhåll av råtttarmorganoider från tolvfingertarmen eller jejunum. Dessutom beskrivs flera nedströmsapplikationer, inklusive lentiviral infektion, helmonteringsfärgning och forskolin svullnadsanalyser.
Utvecklingen av en tarmorganisationsmodell på råttor bevarar viktiga funktionella egenskaper som finns i organet in vivo och är ett lovande verktyg för prekliniska tester, läkemedelsscreening och funktionella analyser. Denna in vitro-modell kan användas parallellt med prekliniska gastroenterologiska studier in vivo , för vilka råttor ofta är en föredragen modell på grund av deras större tarmstorlek, delade fysiologiska aspekter med människor och i vissa fall är bättre sjukdomsmodeller38. Här beskrivs ett robust steg-för-steg-protokoll för isolering av råtttarmkryptor, generering och långtidsodling av råtttarmorganoider, såväl som nedströmsapplikationer inklusive funktionella forskolinsvullnadsanalyser, immunfluorescens på hela berget, 2D-monolagerodling och lentiviral genetisk manipulation. Tarmorganoider från råttor är sannolikt relevanta i många sjukdomssammanhang där patofysiologin hos musmodeller är olämplig och kan ge en bättre modell för mänsklig tarmfysiologi jämfört med mustarmsorganoider.
För att etablera långlivade organoidkulturer som kan passera och expanderas är det viktigt att identifiera de viktigaste tillväxtfaktorerna som krävs för att upprätthålla tarmepitelproliferationen. Musorganoider odlas oftast i en enkel cocktail av EGF, R-spondin och Noggin, även om det har rapporterats att Noggin inte är nödvändigt för tarmorganoidodling39. Konditionerade medier kan ersätta rekombinanta tillväxtfaktorer och de vanligaste cellinjerna är L-WRN, som utsöndrar Wnt3a, Rspondin-3 och Noggin39, L-Wnt3a och HA-Rspondin1-Fc 293T-celler40. L-WRN-konditionerade medier är tillräckliga för att stödja inte bara mustarmens39 organoidtillväxt, utan även tillväxten av tarmorganoider från flera husdjur och sällskapsdjur, inklusive hundar, katter, kycklingar, hästar, kor, får och grisar12. Mänskliga tarmorganoider är dock mycket olika i sina krav på tillväxtfaktorer, eftersom de kräver distinkta medieformuleringar för sin expansionstillväxtfas (dvs. progressionen från små till stora sfäroider) kontra deras differentieringsfas (dvs. generering och mognad av differentierade celltyper)10. Mediekraven för råtttarmsorganoider speglar nära de för expansionsodlingsmediet för mänskliga tarmorganoider, men framför allt kan råttorganoider både växa och differentiera sig i denna mediemiljö, vilket avsevärt förenklar deras odlingskrav. Medan våra första försök fokuserade på att etablera och odla tarmorganoider från råttor i L-WRN-betingade medier, var långtidsodlingen svag och råtttarmens organoidlinjer led av brist på robusthet (data visas inte). Detta kan bero på att L-WRN-cellinjer är konstruerade för att utsöndra R-spondin 3, medan 293T-Rspo1-cellinjen som rekommenderas här är konstruerad för att utsöndra R-spondin 1. Det är möjligt att råttor och mänskliga organoider föredrar R-spondin 1, vilket potentiellt kan förklara misslyckandet av råttorganoidlinjer i L-WRN-konditionerade medier.
För att så nära som möjligt rekapitulera in vivo-miljön är det viktigt att utveckla organoidodlingsbetingelser som möjliggör stamcellers överlevnad, underhåll och proliferation, och som kan upprätthålla cellulär omsättning och samtidiga differentieringshändelser till diskreta celltyper. Därför måste koncentrationerna av rekombinanta proteiner och/eller proteiner i konditionerade medier titreras och kontrolleras noggrant för att uppnå denna perfekta balans. I synnerhet är optimala Wnt-nivåer viktiga för att undvika förlust av tarmorganoidkulturer. För lite Wnt i betingade medier kommer att vara oförmögna att stödja tillväxten, vilket leder till förlust av stamceller och efterföljande organoiddöd; överaktivering av Wnt kommer att leda till att organoider blir cystiska och odifferentierade10. Även om det inte beskrivs här, rekommenderas det starkt att testa varje sats av L-Wnt3a- och 293T-Rspo1-konditionerade medier med hjälp av en Wnt-reporterluciferasanalys, såsom en Topflash-cellinje41. Tidigare studier har beskrivit att en optimal sats av L-Wnt3a-media bör resultera i en 15-faldig signalökning vid 12,5 % och en 300-faldig signalökning vid 50 %, jämfört med 1 % L-Wnt3a10. Eftersom råttorganoider är känsligare än musorganoider för odlingskrav, särskilt Wnt-aktiveringsnivåer, bidrar dessa ytterligare kvalitetskontrollsteg i hög grad till att underlätta robustheten och tillförlitligheten hos råttorganoidkulturer. Eftersom en liknande rapportlinje inte finns tillgänglig för att testa Bmp-aktivitet och relativa Noggin-koncentrationer i Noggin-konditionerade medier, är det tillrådligt att använda rekombinant Noggin när det är möjligt för att exakt kontrollera Noggin-nivåerna. Även om tarmorganoider från möss kan odlas och bibehållas i frånvaro av Noggin39, har detta inte gjorts för organoidkulturer från råtttarmar.
Utöver cellodlingskraven beror den framgångsrika initiala etableringen av en råttorganoidlinje kritiskt på den effektiva utarmningen av differentierade villi under kryptisolering. Höga nivåer av villarkontaminering orsakar kryptdöd, förmodligen på grund av antingen signaler från de döende cellerna eller bindning av viktiga faktorer. För att tömma dessa differentierade villi från epitelpreparat exakt och konsekvent, rekommenderas det att utföra epitelisoleringar med hjälp av ett stereoskop. Visuell undersökning av epitelet som frigörs ger en tydlig signal om när man ska kassera PBS och ersätta den (figur 1). Kryptor bör inte samlas in förrän det finns tillräcklig utarmning av villi. Villarceller är terminalt differentierade och kan inte generera organoider i odling. Dessutom kräver efterföljande passage av råtttarmorganoider och deras användning för någon nedströms applikation känslig vård. Inkubation i dissociationsreagenser under längre tidsperioder (10 min) resulterar i signifikant celldöd och förlust av organoidlinjen.
Här beskrivs ett enkelt och snabbt protokoll för att generera tarmmonolager från råttorganoider. EME- och kollagen I-substrat har olika effekter på epitelet, som kan utnyttjas beroende på syftet med studien. EME möjliggör snabb och effektiv vidhäftning av enskilda celler och bildandet av cellprojektioner. Däremot fördröjer beläggning av ytan med kollagen I dessa processer. När monolager når cirka 80 % sammanflöde börjar celler som odlas på EME att generera 3D-organoidstrukturer igen. De saknar dock tillräckligt fysiskt och kemiskt stöd för fortsatt tillväxt. Denna återgång till organoidtillståndet kan förhindras genom att upprätthålla monolager i EME vid ett sammanflöde på 50%-80%. Tillsatsen av utspädd EME till den apikala ytan av monolager främjar snabb återhämtning och bildning av de novo-organoider, vilket genererar konvergensregioner snabbare och lättare. På en kollagen I-yta kan celler bilda ett enhetligt monolager och generera små kluster. Tillsatsen av kollagen I ovanpå monolager är dock inte tillräcklig för att inducera organoidbildning. EME måste spädas ut när man lägger till monolagerytan, eftersom det kommer att finnas ett starkare mekaniskt motstånd för den begynnande organoiden att övervinna. Denna utspädda EME tillåter dock inte en robust bildning av stora organoider. Alla de novo-genererade råttorganoider som naturligt lossnar från ytan måste omedelbart avlägsnas och överföras till outspädd EME så att strukturellt stöd och tillväxt kan återställas. På grund av den lilla storleken på organoiderna i detta steg rekommenderas inte passage av organoider förrän robust tillväxt har etablerats. Den underliggande biologiska betydelsen av varför EME kan stödja reformationen av organoider, men om kollagen I kan eller inte kan göra detta, är inte klarlagt. Det har dock förekommit rapporter om att celler som odlas i 3D-kollagen inte kan bilda knoppade organoider42,43 eller stödja långsiktigt underhåll. Kommersiellt tillgängliga EME-produkter är heterogena blandningar av extracellulära proteiner, främst laminin och kollagen IV44. Därför kan den distinkta sammansättningen av proteiner och förmågan hos en epitelcell att engagera sig i den extracellulära matrisen med hjälp av olika cellulära komplex möjliggöra ombyggnad i EME men inte kollagen I. Huruvida kollagen I-härledda monolager kan sättas in i EME för att stödja organoidbildning och tillväxt har inte testats.
Genetisk manipulation av råtttarmens organoidmodell beskrivs här, och protokoll för lentiviral transduktion av 3D-organoider och transient transfektion av 2D-monolager beskrivs. För att övervinna den låga effektiviteten av lentiviral organoidtransduktion utvecklades ett protokoll för transient transfektion av 2D-monolager. Den platta morfologin och de exponerade apikala domänerna hos monolager ger lättare tillgång till virus och DNA-innehållande komplex. Uttrycket av en EGFP-rapportör som använde pLJM1-EGFP-vektorn användes för validering av denna teknik. GFP-reporterns uttryck observerades efter 24 timmar och bibehölls i 5-6 dagar i monolager. Framtida studier som fokuserar på lentiviral transduktion av monolager kommer sannolikt att ha högre effektivitet än 3D-organoidtransduktion. Med hjälp av ovanstående protokoll kan 3D-organoider reformeras från infekterade 2D-monolager för att underlätta skapandet av stabila linjer. Med försiktighet kan råtttarmorganoider framgångsrikt upprätthållas i över ett år, förbli stabila över många passager, kryokonserveras, framgångsrikt tinas och genetiskt modifieras med hjälp av lentiviral transduktion, vilket tillgodoser behovet av en tillgänglig och hanterbar in vitro tarmorganoidmodell som behåller fysiologisk relevans för människor.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmarna i Sumigray- och Ameen-laboratorierna för deras tankeväckande diskussioner. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Charles H. Hood Foundation Child Health Grant och ett bidrag från Cystic Fibrosis Foundation (004741P222) till KS och av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health till NA under tilldelningsnummer 2R01DK077065-12.
3-D Culture Matrix Rat Collagen I | Cultrex/R&D Systems | 3447-020-01 | |
70 µm cell strainer | Corning/Falcon | 352350 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco/Thermo Fisher | 12634010 | |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
CryoStor | Stem Cell Technologies | 100-1061 | |
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells | R & D Systems | 3710-001-01 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes/Thermo Fisher | D1306 | |
FBS | Gibco/Thermo Fisher | 16-000-044 | |
Gastrin I (human) | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 100-0485 | |
Glutamax | Thermo Fisher | 35-050-061 | |
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free | Corning | 356231 | |
HEPES | AmericanBio | AB06021 | |
Lanolin | Beantown Chemical | 144255-250G | |
L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher | A2916801 | |
L-Wnt3a cells | ATCC | CRL-2647 | |
N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher | 17502-048 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco/Thermo Fisher | 31985070 | |
Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Thermo Fisher | 15140122 | |
pLJM1-EGFP | Addgene | 19319 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) | Sigma Aldrich | 764965 | |
p-phenylenediamine | Acros Organics/Thermo Fisher | 417481000 | |
Puromycin | VWR | J593-25mg | |
Recombinant human FGF2 protein | Peprotech | 100-18B-250ug | |
Recombinant human IGF-1 protein | Biolegend | B356441 | |
Recombinant human Noggin protein | R & D Systems | 6057-NG-100 | |
Recombinant mouse EGF protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
Sprague Dawley rat | Charles River Laboratories | Strain 001 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco/Thermo Fisher | 12604013 | |
Y27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 |