Arricchimento di mRNA e preparazione della libreria bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione
Summary
Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro facile da seguire per condurre la purificazione dell’RNA poli(A), la conversione del bisolfito e la preparazione della libreria utilizzando apparecchiature standardizzate per un campione biologico di interesse.
Abstract
Le modificazioni post-trascrizionali dell’RNA in vari tipi di trascritti di RNA sono associate a diverse regolazioni dell’RNA nelle cellule eucariotiche. È stato dimostrato che le modificazioni aberranti dell’RNA 5-metilcitosina e l’espressione disregolata delle metiltransferasi dell’RNA sono associate a varie malattie, compresi i tumori. Il sequenziamento del bisolfito a livello di trascrittoma è stato sviluppato per caratterizzare le posizioni e i livelli quantitativi di metilazione della citosina nell’RNA convertito in bisolfito alla risoluzione della coppia di basi. In questo documento, questo protocollo presenta in dettaglio le procedure di due cicli di purificazione del poli(A) RNA, tre cicli di reazione del bisolfito e la preparazione della libreria per consentire la mappatura a livello di trascrittoma dei siti di modificazione dell’mRNA 5-metilcitosina. La valutazione della quantità e della qualità dell’RNA dopo la reazione principale è essenziale per monitorare l’integrità dell’RNA ed è un passaggio fondamentale per garantire librerie di sequenziamento di alta qualità. Idealmente, le procedure possono essere completate entro tre giorni. Con questo protocollo, l’utilizzo di RNA totale di alta qualità come input può praticamente costruire robuste librerie di bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione dal campione di interesse.
Introduction
Tra oltre 150 tipi di modificazioni post-trascrizionali1, la modificazione della 5-metilcitosina (m5C) è stata identificata in vari tipi di RNA, tra cui l’RNA ribosomiale, l’RNA di trasferimento, l’RNA messaggero, il micro RNA, l’RNA lungo non codificante, l’RNA del vault, l’RNA enhancer e i piccoli RNA specifici del corpo cajal2. L’RNA m 5 C è associato a diversi meccanismi biologici e patologici come la regolazione dello sviluppo delle radici delle piante3, l’espressione genica virale4 e la progressione del cancro5. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire pipeline semplificate per caratterizzare il profilo di modificazione dell’mRNA m5C a livello di trascrittoma di campioni biologici in diversi stadi di sviluppo o nel contesto della malattia. Il sequenziamento del bisolfito a livello di trascrittoma è stato sviluppato per caratterizzare le posizioni e i livelli quantitativi di metilazione della citosina nell’RNA convertito in bisolfito alla risoluzionedella coppia di basi 6,7,8,9. Ciò è particolarmente utile quando si studia l’associazione dim5C con l’espressione genica e il destino dell’RNA che è coinvolto nei meccanismi di regolazione biologica nelle cellule. Nella cellula di mammifero, ci sono due lettori noti di m 5 C: ALYREF può riconoscere m 5 C nel nucleo e funge da trasportatore da nucleo mRNA a citosol10, mentre YBX1 può riconoscere m5C nel citoplasma e aumentare la stabilizzazione dell’mRNA11. Nelle cellule T CD4+ CD4+ del lupus eritematososistemico sono stati riportati mRNA m5C aberranti correlati alle vie immunitarie 12. Gli studi hanno rivelato un’associazione tra la modificazione dell’mRNA m5C e la modulazione dell’immunità del cancro e la progressione del cancro13,14. Pertanto, la mappatura del profilo di modificazione di m5C sull’mRNA può fornire informazioni cruciali per chiarire il potenziale meccanismo regolatorio.
Per studiare i ruoli funzionali della modificazione dell’RNA m 5 C in determinate condizioni biologiche, gli approcci basati sulla conversione del bisolfito (bsRNA-seq) e sull’arricchimento dell’affinità anticorpale come m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq e 5-Aza-seq possono essere combinati con la piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento per fornire un rilevamento efficiente di regioni e sequenze mirate con le modifiche m5C su una scala a livello di trascrittoma15, Ore 16. Il vantaggio di questo protocollo fornisce il panorama completo dell’RNA m 5 C con una risoluzione a base singola, poiché l’approccio basato sull’arricchimento dell’affinità anticorpale si basa sulla disponibilità di anticorpi di alta qualità e potrebbe raggiungere la risoluzionea singolo frammento del paesaggio di metilazione m5C17.
Tutti i campioni di RNA saranno processati con due cicli di arricchimento di mRNA utilizzando perle oligo(dT), tre cicli di reazione con bisolfito e la preparazione della libreria di sequenziamento. Per monitorare la qualità dell’RNA, ogni campione di RNA sarà esaminato mediante elettroforesi su gel capillare prima e dopo le procedure di purificazione dell’mRNA e reazione del bisolfito per valutare la distribuzione dei frammenti. Le librerie purificate saranno esaminate in base alle loro qualità di ampliconi PCR, ai frammenti di distribuzione dimensionale del DNA mediante elettroforesi su gel capillare e alle loro quantità complessive esaminate mediante saggi quantitativi basati su coloranti a fluorescenza prima del sequenziamento. Il sistema può anche essere utilizzato per analizzare un ampio spettro di campioni biologici come prodotti agricoli, virioni isolati, linee cellulari, organismi modello e campioni patologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, è stata ottenuta una pipeline dettagliata di arricchimento di poli(A), conversione di bisolfito e preparazione della libreria utilizzando componenti standardizzati. Ulteriori analisi di sequenziamento hanno fornito l’identificazione dell’mRNA 5-metilcitosina nei campioni di interesse.
Il passaggio critico è la qualità del materiale di partenza, l’RNA totale, poiché la degradazione dell’RNA avrebbe un impatto sul tasso di recupero della purificazione dell’RNA poli(A). …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio Nazionale per la Scienza e la Tecnologia di Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
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