차세대 염기서열분석을 위한 mRNA 및 Bisulfite-mRNA 라이브러리 준비 농축
Summary
이 프로토콜은 관심 생물학적 샘플에 대해 표준화된 장비를 사용하여 poly(A) RNA 정제, 중아황산염 변환 및 라이브러리 준비를 수행하기 위한 따라하기 쉬운 워크플로우를 제공합니다.
Abstract
다양한 유형의 RNA 전사체에서 RNA 전사 후 변형은 진핵 세포의 다양한 RNA 조절과 관련이 있습니다. 비정상적인 RNA 5-메틸시토신 변형과 RNA 메틸전이효소의 조절 장애 발현은 암을 포함한 다양한 질병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 전사체 전체 중아황산염 염기서열분석은 염기쌍 분해능에서 중아황산염 변환 RNA의 위치와 정량적 사이토신 메틸화 수준을 특성화하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 이 프로토콜은 mRNA 5-메틸시토신 변형 부위의 전사체 전체 매핑을 허용하기 위해 2라운드의 폴리(A) RNA 정제, 3주기의 중아황산염 반응 및 라이브러리 준비 절차를 자세히 제시합니다. 주요 반응 후 RNA의 양과 질을 평가하는 것은 RNA 무결성을 모니터링하는 데 필수적이며 고품질 염기서열분석 라이브러리를 보장하기 위한 중요한 단계입니다. 이상적으로는 3일 이내에 절차를 완료할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 고품질 total RNA를 입력으로 사용하면 관심 샘플에서 차세대 염기서열분석을 위한 강력한 bisulfite-mRNA 라이브러리를 실질적으로 구축할 수 있습니다.
Introduction
150가지 이상의 전사 후 변형(post-transcriptional modifications)1 중 5-메틸시토신(m5C) 변형은 리보솜 RNA, 전달 RNA, 메신저 RNA, 마이크로 RNA, 긴 비코딩 RNA, 금고 RNA, 인핸서 RNA, 작은 카잘체 특이적 RNA를 포함한 다양한 유형의 RNA에서 확인되었습니다2. RNA m 5 C는 식물 뿌리 발달 조절3, 바이러스 유전자 발현4 및 암 진행5과 같은 다양한 생물학적 및 병리학적 메커니즘과 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 다양한 발달 단계 또는 질병 환경에서 생물학적 샘플의 전사체 전체 mRNA m5C변형 프로파일을 특성화하기 위한 간소화된 파이프라인을 제공하는 것입니다. 전사체 전체 중아황산염 염기서열분석은 염기쌍 분해능 6,7,8,9에서 중아황산염 변환 RNA의 위치 및 정량적 시토신 메틸화 수준을 특성화하기 위해 개발되었습니다. 이것은 세포의 생물학적 조절 메커니즘에 관여하는 유전자 발현 및 RNA 운명과 m5C의 연관성을 연구할 때 특히 유용합니다. 포유류 세포에는 두 개의 알려진 m5C 판독기가 있다: ALYREF는 핵에서 m5C를 인식할 수 있고 mRNA 핵-세포질 수송체(10) 역할을 하는 반면, YBX1은 세포질에서m5C를 인식하고 mRNA 안정화를 증가시킬 수 있다(11). 면역 경로와 관련된 비정상적인 m5CmRNA는 전신성 홍반성 루푸스 CD4+ T 세포에서 보고되었다12. 연구에 따르면 mRNA m5C 변형과 암 면역 및 암 진행 조절 사이의 연관성이 밝혀졌습니다13,14. 따라서 mRNA에서 m5C변형 프로파일을 매핑하면 잠재적인 조절 메커니즘을 설명하는 데 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.
특정 생물학적 조건 하에서 RNA m5C 변형의 기능적 역할을 조사하기 위해, m5 C-RIP-seq, miCLIP-seq 및 5-Aza-seq와 같은 중아황산염 전환 기반(bsRNA-seq) 및 항체 친화성 농축 기반 접근법을 고처리량 염기서열분석 플랫폼과 결합하여 전사체 전체 규모에서m5C변형으로 표적 영역 및 염기서열을 효율적으로 검출할 수 있습니다15, 16. 이 프로토콜의 장점은 항체 친화성 농축 기반 접근법이 고품질 항체의 가용성에 의존하고 m5C메틸화 환경17의 단일 단편 분리능을 달성할 수 있기 때문에 단일 염기 분해능에서 포괄적인 RNA m5C 환경을 제공합니다.
모든 RNA 샘플은 올리고(dT) 비드를 사용한 2라운드의 mRNA 농축, 3주기의 중아황산염 반응 및 염기서열분석 라이브러리 준비로 처리됩니다. RNA 품질을 모니터링하기 위해 각 RNA 샘플은 mRNA 정제 및 중아황산염 반응 절차 전후에 모세관 겔 전기영동으로 검사하여 단편 분포를 평가합니다. 정제된 라이브러리는 PCR 앰플리콘 품질, 모세관 겔 전기영동에 의한 DNA 크기 분포 단편, 염기서열분석 전에 형광 염료 기반 정량 분석으로 검사한 전체 수량으로 검사됩니다. 이 시스템은 농산물, 분리된 바이러스, 세포주, 모델 유기체 및 병리학적 표본과 같은 광범위한 생물학적 샘플을 분석하는 데에도 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는 표준화된 구성 요소를 활용하여 폴리(A) 농축, 중아황산염 변환 및 라이브러리 준비의 상세한 파이프라인을 달성했습니다. 추가 염기서열분석 분석을 통해 관심 샘플에서 mRNA 5-methylcytosine을 식별할 수 있었습니다.
중요한 단계는 RNA의 분해가 poly(A) RNA 정제의 회수율에 영향을 미치기 때문에 출발 물질-총 RNA의 품질입니다. poly(A) RNA 정제 단계를 수행하기 전?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 대만 국가과학기술위원회(National Science and Technology Council of Taiwan)의 지원을 받았습니다. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
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