Denne protokol giver en let at følge arbejdsgang til at udføre poly (A) RNA-oprensning, bisulfitkonvertering og biblioteksforberedelse ved hjælp af standardiseret udstyr til en biologisk prøve af interesse.
RNA posttranskriptionelle modifikationer i forskellige typer RNA-transkripter er forbundet med forskellig RNA-regulering i eukaryote celler. Afvigende RNA-5-methylcytosinmodifikationer og den dysregulerede ekspression af RNA-methyltransferaser har vist sig at være forbundet med forskellige sygdomme, herunder kræftformer. Transkriptom-bred bisulfitsekventering blev udviklet til at karakterisere positionerne og de kvantitative cytosinmethyleringsniveauer i det bisulfitkonverterede RNA ved baseparopløsningen. Heri præsenterer denne protokol procedurerne for to runder af poly (A) RNA-oprensning, tre cyklusser af bisulfitreaktion og biblioteksforberedelse i detaljer for at muliggøre transkriptom-dækkende kortlægning af mRNA 5-methylcytosinmodifikationssteder. Vurderingen af RNA-mængde og kvalitet efter hovedreaktionen er afgørende for at overvåge RNA-integritet og er et kritisk skridt for at sikre sekventeringsbiblioteker af høj kvalitet. Ideelt set kan procedurerne afsluttes inden for tre dage. Med denne protokol kan brug af total RNA af høj kvalitet som input praktisk talt opbygge robuste bisulfit-mRNA-biblioteker til næste generations sekventering fra prøven af interesse.
Blandt over 150 typer posttranskriptionelle modifikationer1 er 5-methylcytosin (m5C) modifikation blevet identificeret i forskellige typer RNA’er, herunder ribosomalt RNA, overførsels-RNA, messenger-RNA, mikro-RNA, langt ikke-kodende RNA, hvælvings-RNA, forstærker-RNA og små cajal-kropsspecifikke RNA’er2. RNA m 5 C er forbundet med forskellige biologiske og patologiske mekanismer såsom regulering af planterodsudvikling3, viral genekspression4 og kræftprogression5. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe strømlinede rørledninger til karakterisering af den transkriptom-brede mRNA m5C modifikationsprofil af biologiske prøver i forskellige udviklingsstadier eller i sygdomsindstillingen. Transkriptom-dækkende bisulfitsekventering blev udviklet til at karakterisere positionerne og de kvantitative cytosinmethyleringsniveauer i det bisulfitkonverterede RNA ved baseparopløsning 6,7,8,9. Dette er især nyttigt, når man studerer sammenhængen mellem m5C og genekspression og RNA-skæbne, der er involveret i de biologiske reguleringsmekanismer i celler. I pattedyrcellen er der to kendte m 5 C-læsere: ALYREF kan genkende m 5 C ved kernen og fungerer som en mRNA-kerne-til-cytosoltransportør10, mens YBX1 kan genkende m5C i cytoplasmaet og øge mRNA-stabilisering11. Afvigende m5C mRNA’er relateret til immunveje blev rapporteret i systemiske lupus erythematosus CD4+ T-celler12. Undersøgelser har afsløret en sammenhæng mellem mRNA m5C modifikation og modulering af kræftimmunitet og kræftprogression13,14. Derfor kan kortlægning af m5C-modifikationsprofilen på mRNA’et give afgørende information til belysning af det potentielle reguleringsmaskineri.
For at undersøge de funktionelle roller af RNA m5 C-modifikation under visse biologiske betingelser kan de bisulfitkonverteringsbaserede (bsRNA-seq) og antistofaffinitetsberigelsesbaserede tilgange såsom m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq og 5-Aza-seq kombineres med high-throughput sekventeringsplatformen for at give effektiv detektion af målrettede regioner og sekvenser med m5C-modifikationerne på entranskriptom-bred skala15, 16. Fordelen ved denne protokol giver det omfattende RNA m 5C-landskab ved en enkeltbaseopløsning, da den antistofaffinitetsberigelsesbaserede tilgang er afhængig af tilgængeligheden af antistoffer af høj kvalitet og kunne opnå enkeltfragmentopløsningen af m5C methyleringslandskab17.
Alle RNA-prøver behandles med to runder mRNA-berigelse ved hjælp af oligo (dT) perler, tre cyklusser af bisulfitreaktion og sekventeringsbibliotekets forberedelse. For at overvåge RNA-kvaliteten undersøges hver RNA-prøve ved kapillærgelelektroforese før og efter procedurerne for mRNA-oprensning og bisulfitreaktion for at vurdere fragmentfordelingen. De oprensede biblioteker vil blive undersøgt ved deres PCR-amplikonkvaliteter, DNA-størrelsesfordelingsfragmenter ved kapillærgelelektroforese og deres samlede mængder undersøgt ved fluorescensfarvestofferbaserede kvantitative assays inden sekventering. Systemet kan også bruges til at analysere et bredt spektrum af biologiske prøver såsom landbrugsprodukter, isolerede virioner, cellelinjer, modelorganismer og patologiske prøver.
I denne protokol blev en detaljeret pipeline af poly (A) berigelse, bisulfitkonvertering og biblioteksforberedelse opnået ved at anvende standardiserede komponenter. Yderligere sekventeringsanalyse tilvejebragte identifikation af mRNA 5-methylcytosin i prøver af interesse.
Det kritiske trin er kvaliteten af udgangsmaterialet – total RNA – da nedbrydningen af RNA ville påvirke genvindingshastigheden for poly (A) RNA-oprensning. Prøven skal håndteres omhyggeligt, og RNase-kontaminering undg…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Science and Technology Council of Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |