Arricchimento di mRNA e preparazione della libreria bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione

Sommario

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro facile da seguire per condurre la purificazione dell'RNA poli(A), la conversione del bisolfito e la preparazione della libreria utilizzando apparecchiature standardizzate per un campione biologico di interesse.

Abstract

Le modificazioni post-trascrizionali dell'RNA in vari tipi di trascritti di RNA sono associate a diverse regolazioni dell'RNA nelle cellule eucariotiche. È stato dimostrato che le modificazioni aberranti dell'RNA 5-metilcitosina e l'espressione disregolata delle metiltransferasi dell'RNA sono associate a varie malattie, compresi i tumori. Il sequenziamento del bisolfito a livello di trascrittoma è stato sviluppato per caratterizzare le posizioni e i livelli quantitativi di metilazione della citosina nell'RNA convertito in bisolfito alla risoluzione della coppia di basi. In questo documento, questo protocollo presenta in dettaglio le procedure di due cicli di purificazione del poli(A) RNA, tre cicli di reazione del bisolfito e la preparazione della libreria per consentire la mappatura a livello di trascrittoma dei siti di modificazione dell'mRNA 5-metilcitosina. La valutazione della quantità e della qualità dell'RNA dopo la reazione principale è essenziale per monitorare l'integrità dell'RNA ed è un passaggio fondamentale per garantire librerie di sequenziamento di alta qualità. Idealmente, le procedure possono essere completate entro tre giorni. Con questo protocollo, l'utilizzo di RNA totale di alta qualità come input può praticamente costruire robuste librerie di bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione dal campione di interesse.

Introduzione

Tra oltre 150 tipi di modificazioni post-trascrizionali¹, la modificazione della 5-metilcitosina (m⁵C) è stata identificata in vari tipi di RNA, tra cui l'RNA ribosomiale, l'RNA di trasferimento, l'RNA messaggero, il micro RNA, l'RNA lungo non codificante, l'RNA del vault, l'RNA enhancer e i piccoli RNA specifici del corpo cajal². L'RNA m 5 C è associato a diversi meccanismi biologici e patologici come la regolazione dello sviluppo delle radici delle piante³, l'espressione genica virale⁴ e la progressione del cancro⁵. Lo scopo d....

Protocollo

1. Purificazione dell'RNA di poli(A)

NOTA: Utilizzare l'RNA totale trattato con DNasi I ed esaminare la qualità e l'integrità dell'RNA totale mediante valutazione dell'elettroforesi capillare o su gel convenzionale prima di procedere alla purificazione dell'RNA poli(A). I ricercatori dovrebbero essere in grado di identificare le bande ribosomiali dell'rRNA 28S e 18S nel campo ad alto peso molecolare e la banda dell'rRNA 5,8S nel campo a basso peso molecolare senza bande di striscio significative nell'elettroferogramma. Le fasi di purificazione seguono essenzialmente le istruzioni del produttore con piccole modifiche indicate ....

Risultati

Una serie di librerie bsRNA-seq da linee cellulari¹⁹ sono state generate seguendo le procedure descritte in questo rapporto (Figura 1). Dopo la purificazione totale dell'RNA accompagnata dal trattamento DNase eseguito su campioni di linee cellulari e la qualità controllata mediante elettroforesi su gel e spettrofotometria UV-Vis (A260/A280), il campione di RNA può procedere all'arricchimento di poli(A) RNA. Per determinare se la doppia purificazione p.......

Discussione

In questo protocollo, è stata ottenuta una pipeline dettagliata di arricchimento di poli(A), conversione di bisolfito e preparazione della libreria utilizzando componenti standardizzati. Ulteriori analisi di sequenziamento hanno fornito l'identificazione dell'mRNA 5-metilcitosina nei campioni di interesse.

Il passaggio critico è la qualità del materiale di partenza, l'RNA totale, poiché la degradazione dell'RNA avrebbe un impatto sul tasso di recupero della purificazione dell'RNA poli(A). Il c.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agilent 2100 Sistema di bioanalizzatore per elettroforesi	Agilent, Santa Clara, CA		Rilevamento della qualità dell'RNA
Perline AMpure XP	Beckman Coulter	A63881	purificare il DNA
Bioanalizzatore Kit DNA ad alta sensibilità	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	Rilevamento della qualità del DNA
Bioanalizzatore RNA 6000 Kit	Pico Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA rilevamento della qualità
DiaMag02 - rack magnetico	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assistere la preparazione della libreria
DiaMag1.5 - rack magnetico	Diagenode, Denville, NJ	B04000003 assistere la	purificazione dell'RNA poly(A)
Kit di purificazione DIRETTA dell'mRNA Dynabeads	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	purificazione dell'RNA poli(A); Tampone di lavaggio 1 e tampone di lavaggio 2
Etanolo	J.T.Baker	64-17-5
Kit di metilazione dell'RNA EZ	Zymo, Irvine, CA	R5002	trattamento con bisolfito
Firefly luciferasi mRNA	Promega, Madison, WI, USA	Picco L4561	nella seqeunce di controllo
Kit di quantificazione della libreria KAPA	Roche, Svizzera	Quantificazione della libreria	KK4824
Spettrofotometro a nanogocce	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Rilevamento		della quantità di RNA totale
NEBNext multiplex Oligos per illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	Preparazione
della libreria E7335SNEBNext Ultra Kit di preparazione della libreria di RNA direzionale per Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	Preparazione della libreria E7760S
Acqua senza nucleasi	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorimetro	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Rilevamento della quantità di RNA
Kit di analisi Qubit dsDNA HS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	Rilevamento della quantità di DNA
Kit di analisi Qubit RNA HS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	Rilevamento della quantità di RNA