Denne protokollen gir en enkel å følge arbeidsflyt for å gjennomføre poly (A) RNA-rensing, bisulfittkonvertering og bibliotekforberedelse ved hjelp av standardisert utstyr for en biologisk prøve av interesse.
RNA posttranskripsjonelle modifikasjoner i forskjellige typer RNA-transkripsjoner er assosiert med mangfoldig RNA-regulering i eukaryote celler. Avvikende RNA 5-metylcytosinmodifikasjoner og det dysregulerte uttrykket av RNA-metyltransferaser har vist seg å være assosiert med forskjellige sykdommer, inkludert kreft. Transkriptombrede bisulfittsekvensering ble utviklet for å karakterisere posisjonene og de kvantitative cytosinmetyleringsnivåene i det bisulfittkonverterte RNA ved baseparoppløsningen. Her presenterer denne protokollen prosedyrene for to runder med poly (A) RNA-rensing, tre sykluser av bisulfittreaksjon og bibliotekforberedelse i detalj for å tillate transkriptomomfattende kartlegging av mRNA 5-metylcytosinmodifikasjonssteder. Vurderingen av RNA-kvantitet og kvalitet etter hovedreaksjonen er avgjørende for å overvåke RNA-integriteten og er et kritisk skritt for å sikre sekvenseringsbiblioteker av høy kvalitet. Ideelt sett kan prosedyrene fullføres innen tre dager. Med denne protokollen kan bruk av total RNA av høy kvalitet som inngang praktisk talt bygge opp robuste bisulfitt-mRNA-biblioteker for neste generasjons sekvensering fra prøven av interesse.
Blant over 150 typer post-transkripsjonelle modifikasjoner1, 5-metylcytosin (m5C) modifikasjon har blitt identifisert i ulike typer RNA, inkludert ribosomal RNA, overføring RNA, messenger RNA, mikro RNA, lang ikke-kodende RNA, vault RNA, enhancer RNA og små cajal kroppsspesifikke RNA2. RNA m 5 C er assosiert med ulike biologiske og patologiske mekanismer som regulering av planterotutvikling3, viral genuttrykk4 og kreftprogresjon5. Målet med denne protokollen er å gi strømlinjeformede rørledninger for å karakterisere den transkriptombrede mRNA m5C modifikasjonsprofilen til biologiske prøver i forskjellige utviklingsstadier eller i sykdomsinnstillingen. Transkriptombrede bisulfittsekvensering ble utviklet for å karakterisere posisjonene og de kvantitative cytosinmetyleringsnivåene i det bisulfittkonverterte RNA ved baseparoppløsning 6,7,8,9. Dette er spesielt nyttig når man studerer sammenhengen mellom m5C og genuttrykk og RNA-skjebne som er involvert i de biologiske reguleringsmekanismene i celler. I pattedyrcellen er det to kjente m 5 C-lesere: ALYREF kan gjenkjenne m 5 C ved kjernen og fungerer som en mRNA-kjerne-til-cytosoltransportør10, mens YBX1 kan gjenkjenne m5C i cytoplasma og øke mRNA-stabilisering11. Avvikende m5C mRNA relatert til immunveier ble rapportert i systemiske Lupus Erythematosus CD4+ T-celler12. Studier har vist en sammenheng mellom mRNA m5C modifikasjon og modulering av kreftimmunitet og kreftprogresjon13,14. Derfor kan kartlegging av m5C modifikasjonsprofilen på mRNA gi viktig informasjon for å belyse det potensielle regulatoriske maskineriet.
For å undersøke de funksjonelle rollene til RNA m 5 C modifikasjon under visse biologiske forhold, kan bisulfittkonverteringsbaserte (bsRNA-seq) og antistoffaffinitetsberikelsesbaserte tilnærminger somm 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq og 5-Aza-seq kombineres med høykapasitetssekvenseringsplattformen for å gi effektiv deteksjon av målrettede regioner og sekvenser med m5C-modifikasjonene på en transkriptom-bred skala15, 16. Fordelen med denne protokollen gir det omfattende RNA m 5C landskapet ved en enkeltbaseoppløsning siden antistoffaffinitetsberikelsesbasert tilnærming er avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer av høy kvalitet og kan oppnå enkeltfragmentoppløsningen av m5C metyleringslandskap17.
Alle RNA-prøver vil bli behandlet med to runder mRNA-anrikning ved bruk av oligo (dT) perler, tre sykluser med bisulfittreaksjon og sekvenseringsbibliotekets forberedelse. For å overvåke RNA-kvaliteten vil hver RNA-prøve bli undersøkt ved kapillær gelelektroforese før og etter prosedyrene for mRNA-rensing og bisulfittreaksjon for å vurdere fragmentfordeling. De rensede bibliotekene vil bli undersøkt av deres PCR-ampliconkvaliteter, DNA-størrelsesfordelingsfragmenter ved kapillær gelelektroforese, og deres samlede mengder undersøkt ved fluorescensfargestoffbaserte kvantitative analyser før sekvensering. Systemet kan også brukes til å analysere et bredt spekter av biologiske prøver som landbruksprodukter, isolerte virioner, cellelinjer, modellorganismer og patologiske prøver.
I denne protokollen ble en detaljert rørledning av poly (A) anrikning, bisulfittkonvertering og bibliotekforberedelse oppnådd ved å benytte standardiserte komponenter. Videre sekvenseringsanalyse ga identifisering av mRNA 5-metylcytosin i prøver av interesse.
Det kritiske trinnet er kvaliteten på startmaterialet – totalt RNA – siden nedbrytningen av RNA vil påvirke utvinningsgraden av poly (A) RNA-rensing. Prøven bør håndteres nøye og RNase-forurensning unngås før poly (A) RNA-rens…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Science and Technology Council of Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |