Este protocolo fornece um fluxo de trabalho fácil de seguir para conduzir a purificação de RNA poli(A), conversão de bissulfito e preparação de biblioteca usando equipamentos padronizados para uma amostra biológica de interesse.
Modificações pós-transcricionais de RNA em vários tipos de transcritos de RNA estão associadas à regulação de diversos RNA em células eucarióticas. Modificações aberrantes do RNA 5-metilcitosina e a expressão desregulada de RNA metiltransferases têm se mostrado associadas a várias doenças, incluindo cânceres. O sequenciamento de bissulfito transdescritor largo foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases. Este protocolo apresenta os procedimentos de duas rodadas de purificação de RNA poli(A), três ciclos de reação de bissulfito e preparação de biblioteca em detalhes para permitir o mapeamento em todo o transcriptoma dos sítios de modificação do RNAm 5-metilcitosina. A avaliação da quantidade e qualidade do RNA após a reação principal é essencial para monitorar a integridade do RNA e é um passo crítico para garantir bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade. O ideal é que os procedimentos possam ser concluídos em até três dias. Com este protocolo, o uso de RNA total de alta qualidade como entrada pode praticamente construir bibliotecas robustas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração a partir da amostra de interesse.
Entre mais de 150 tipos de modificações pós-transcricionais1, a modificação da 5-metilcitosina (m5C) foi identificada em vários tipos de RNAs, incluindo RNA ribossomal, RNA de transferência, RNA mensageiro, micro RNA, RNA longo não codificante, RNA de abóbada, RNA intensificador e RNAs específicos do corpo cajalpequeno 2. O RNA m 5 C está associado a diversos mecanismos biológicos e patológicos, tais como regulação do desenvolvimento radicular de plantas3, expressão gênica viral4 e progressão do câncer5. O objetivo deste protocolo é fornecer pipelines simplificados para caracterizar o perfil de modificação do mRNA m5C do transcriptoma de amostras biológicas em diferentes estágios de desenvolvimento ou no cenário da doença. O sequenciamento transcriptoma-amplo de bissulfito foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases 6,7,8,9. Isto é particularmente útil quando se estuda a associação de m5C com a expressão gênica e o destino do RNA que está envolvido nos mecanismos biológicos regulatórios em células. Na célula de mamíferos, existem dois leitores m 5 C conhecidos: ALYREF pode reconhecer m 5 C no núcleo e serve como um transportador de núcleo de RNAm para citosol10, enquanto YBX1 pode reconhecer m5C no citoplasma e aumentar a estabilização de RNAm11. Foram relatados mRNAs5 Caberrantes relacionados a vias imunes em células T CD4+ do lúpus eritematoso sistêmico12. Estudos têm revelado associação entre modificação do RNAmm 5C e modulação da imunidade do câncer e progressão do câncer13,14. Assim, o mapeamento do perfil demodificação dom5 C no RNAm pode fornecer informações cruciais para elucidar o potencial maquinário regulatório.
Para investigar os papéis funcionais da modificação do RNAm 5 C sob certas condições biológicas, as abordagens baseadas na conversão de bissulfito (bsRNA-seq) e no enriquecimento por afinidade de anticorpos, como m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq e 5-Aza-seq, podem ser combinadas com a plataforma de sequenciamento de alto rendimento para fornecer detecção eficiente de regiões e sequências alvo com as modificações de m5C em uma escala de transcriptoma15, 16º. A vantagem deste protocolo fornece a paisagem abrangente do RNA m 5 C em uma resolução de base única, uma vez que a abordagem baseada no enriquecimento por afinidade de anticorpos depende da disponibilidade de anticorpos de alta qualidade e poderia alcançar a resolução de fragmentoúnico da paisagem de metilação de m5C17.
Todas as amostras de RNA serão processadas com duas rodadas de enriquecimento de RNAm usando esferas de oligo(dT), três ciclos de reação de bissulfito e a preparação da biblioteca de sequenciamento. Para monitorar a qualidade do RNA, cada amostra de RNA será examinada por eletroforese em gel capilar antes e após os procedimentos de purificação do RNAm e reação de bissulfito para avaliar a distribuição dos fragmentos. As bibliotecas purificadas serão examinadas por suas qualidades de amplificação de PCR, fragmentos de distribuição de tamanho de DNA por eletroforese em gel capilar e suas quantidades totais examinadas por ensaios quantitativos baseados em corantes de fluorescência antes do sequenciamento. O sistema também pode ser usado para analisar um amplo espectro de amostras biológicas, como produtos agrícolas, vírions isolados, linhagens celulares, organismos modelo e espécimes patológicos.
Neste protocolo, um pipeline detalhado de enriquecimento de poli(A), conversão de bissulfito e preparação de bibliotecas foi obtido utilizando componentes padronizados. Análises posteriores de sequenciamento forneceram a identificação do RNAm 5-metilcitosina nas amostras de interesse.
A etapa crítica é a qualidade do material de partida – RNA total – uma vez que a degradação do RNA impactaria a taxa de recuperação da purificação do RNA poli(A). A amostra deve ser cuidadosamente m…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia de Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |