Detta protokoll ger ett arbetsflöde som är lätt att följa för att utföra poly(A) RNA-rening, bisulfitomvandling och biblioteksberedning med hjälp av standardiserad utrustning för ett biologiskt prov av intresse.
RNA-posttranskriptionsmodifieringar i olika typer av RNA-transkript är associerade med olika RNA-reglering i eukaryota celler. Avvikande RNA 5-metylcytosinmodifieringar och det dysreglerade uttrycket av RNA-metyltransferaser har visat sig vara associerade med olika sjukdomar, inklusive cancer. Transkriptomomfattande bisulfitsekvensering utvecklades för att karakterisera positionerna och de kvantitativa cytosinmetyleringsnivåerna i det bisulfitomvandlade RNA:t vid basparsupplösningen. Häri presenterar detta protokoll procedurerna för två omgångar av poly(A) RNA-rening, tre cykler av bisulfitreaktion och biblioteksförberedelse i detalj för att möjliggöra transkriptomomfattande kartläggning av mRNA 5-metylcytosinmodifieringsställen. Bedömningen av RNA-kvantitet och -kvalitet efter huvudreaktionen är avgörande för att övervaka RNA-integriteten och är ett kritiskt steg för att säkerställa sekvenseringsbibliotek av hög kvalitet. Helst kan procedurerna slutföras inom tre dagar. Med detta protokoll kan man genom att använda högkvalitativt total-RNA som ingång praktiskt bygga upp robusta bisulfit-mRNA-bibliotek för nästa generations sekvensering från det aktuella provet.
Bland över 150 typer av post-transkriptionella modifieringar1 har modifiering av 5-metylcytosin (m5C) identifierats i olika typer av RNA, inklusive ribosomalt RNA, transfer-RNA, budbärar-RNA, mikro-RNA, långt icke-kodande RNA, valv-RNA, förstärkar-RNA och små cajal-kroppsspecifika RNA2. RNA m 5 C är associerat med olika biologiska och patologiska mekanismer såsom reglering av växtrotutveckling3, viralt genuttryck4 och cancerprogression5. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla strömlinjeformade pipelines för att karakterisera den transkriptomomfattande mRNA m5C-modifieringsprofilen för biologiska prover i olika utvecklingsstadier eller i sjukdomsmiljön. Transkriptomomfattande bisulfitsekvensering utvecklades för att karakterisera positionerna och de kvantitativa cytosinmetyleringsnivåerna i det bisulfitomvandlade RNA:t vid basparsupplösning 6,7,8,9. Detta är särskilt användbart när man studerar sambandet mellanm5C och genuttryck och RNA-öde som är involverat i de biologiska regleringsmekanismerna i celler. I däggdjurscellen finns det två kända m 5 C-läsare: ALYREF kan känna igen m 5 C vid kärnan och fungerar som en mRNA-kärna-till-cytosol-transportör10, medan YBX1 kan känna igen m5C i cytoplasman och ökamRNA-stabiliseringen11. Avvikande m5C-mRNArelaterade till immunvägar rapporterades i systemiska lupus erythematosus CD4+ T-celler12. Studier har visat ett samband mellan mRNAm5C-modifiering och modulering av cancerimmunitet och cancerprogression13,14. Kartläggning avm5C-modifieringsprofilen på mRNA kan därför ge viktig information för att belysa det potentiella regulatoriska maskineriet.
För att undersöka de funktionella rollerna för RNA m5 C-modifiering under vissa biologiska förhållanden kan de bisulfitomvandlingsbaserade (bsRNA-seq) och antikroppsaffinitetsanrikningsbaserade metoderna såsom m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq och 5-Aza-seq kombineras med sekvenseringsplattformen med hög genomströmning för att ge effektiv detektion av målregioner och sekvenser med m5C-modifieringarna på en transkriptomomfattande skala15, 16. veckor Fördelen med detta protokoll ger det omfattande RNA m 5 C-landskapet med en enda basupplösning eftersom den antikroppsaffinitetsanrikningsbaserade metoden är beroende av tillgången på antikroppar av hög kvalitet och kan uppnå upplösningen av ett fragment av m5C-metyleringslandskap17.
Alla RNA-prover kommer att bearbetas med två omgångar mRNA-anrikning med oligo(dT)-pärlor, tre cykler av bisulfitreaktion och sekvenseringsbibliotekets beredning. För att övervaka RNA-kvaliteten kommer varje RNA-prov att undersökas med kapillärgelelektrofores före och efter procedurerna för mRNA-rening och bisulfitreaktion för att bedöma fragmentfördelningen. De renade biblioteken kommer att undersökas med hjälp av deras PCR-amplikonkvaliteter, DNA-storleksfördelningsfragment med kapillärgelelektrofores och deras totala kvantiteter kommer att undersökas med fluorescensfärgningsbaserade kvantitativa analyser före sekvensering. Systemet kan också användas för att analysera ett brett spektrum av biologiska prover såsom jordbruksprodukter, isolerade virioner, cellinjer, modellorganismer och patologiska prover.
I detta protokoll uppnåddes en detaljerad pipeline av poly(A)-anrikning, bisulfitkonvertering och biblioteksförberedelse genom att använda standardiserade komponenter. Ytterligare sekvenseringsanalys gav identifiering av mRNA 5-metylcytosin i prover av intresse.
Det kritiska steget är kvaliteten på startmaterialet – totalt RNA – eftersom nedbrytningen av RNA skulle påverka återvinningshastigheten för poly(A) RNA-rening. Provet ska hanteras noggrant och RNas-kontaminering undvikas innan…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Taiwans nationella vetenskaps- och teknikråd. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |