Bu protokol, ilgilenilen biyolojik bir numune için standartlaştırılmış ekipman kullanarak poli(A) RNA saflaştırması, bisülfit dönüşümü ve kütüphane hazırlığı yapmak için takip edilmesi kolay bir iş akışı sağlar.
Çeşitli RNA transkript tiplerindeki RNA transkripsiyon sonrası modifikasyonlar, ökaryotik hücrelerde çeşitli RNA regülasyonu ile ilişkilidir. Anormal RNA 5-metilsitozin modifikasyonlarının ve RNA metiltransferazların düzensiz ekspresyonunun kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Baz çifti çözünürlüğünde bisülfit dönüştürülmüş RNA’daki pozisyonları ve kantitatif sitozin metilasyon seviyelerini karakterize etmek için transkriptom çapında bisülfit dizileme geliştirilmiştir. Burada, bu protokol, mRNA 5-metilsitozin modifikasyon bölgelerinin transkriptom çapında haritalanmasına izin vermek için iki tur poli(A) RNA saflaştırması, üç döngü bisülfit reaksiyonu ve kütüphane hazırlama prosedürlerini ayrıntılı olarak sunar. Ana reaksiyondan sonra RNA miktarının ve kalitesinin değerlendirilmesi, RNA bütünlüğünü izlemek için gereklidir ve yüksek kaliteli dizileme kitaplıkları sağlamak için kritik bir adımdır. İdeal olarak, prosedürler üç gün içinde tamamlanabilir. Bu protokolle, girdi olarak yüksek kaliteli toplam RNA’nın kullanılması, ilgilenilen örnekten yeni nesil dizileme için pratik olarak sağlam bisülfit-mRNA kitaplıkları oluşturabilir.
150’den fazla transkripsiyon sonrası modifikasyontürü arasında 1, 5-metilsitozin (m5C) modifikasyonu, ribozomal RNA, transfer RNA, haberci RNA, mikro RNA, uzun kodlamayan RNA, tonoz RNA, güçlendirici RNA ve küçük cajal vücuda özgü RNA’lar2 dahil olmak üzere çeşitli RNA tiplerinde tanımlanmıştır. RNA m5C, bitki kök gelişimini3, viral gen ekspresyonu4 ve kanser ilerlemesini5 düzenleme gibi çeşitli biyolojik ve patolojik mekanizmalarla ilişkilidir. Bu protokolün amacı, farklı gelişim aşamalarında veya hastalık ortamında biyolojik örneklerin transkriptom çapında mRNA m5C modifikasyon profilini karakterize etmek için aerodinamik boru hatları sağlamaktır. Baz çifti çözünürlüğü 6,7,8,9’da bisülfit dönüştürülmüş RNA’daki pozisyonları ve kantitatif sitozin metilasyon seviyelerini karakterize etmek için transkriptom çapında bisülfit dizileme geliştirilmiştir. Bu, özelliklem5C’nin hücrelerdeki biyolojik düzenleyici mekanizmalarda yer alan gen ekspresyonu ve RNA kaderi ile ilişkisini incelerken yararlıdır. Memeli hücresinde bilinen iki m5 C okuyucusu vardır: ALYREF, çekirdektem5C’yitanıyabilir ve bir mRNA çekirdeğinden sitozole taşıyıcısı 10 olarak hizmet ederken, YBX1 sitoplazmadam5C’yi tanıyabilir ve mRNA stabilizasyonunu artırabilir11. Sistemik Lupus Eritematozus CD4+ T hücrelerinde immün yolaklarla ilgili anormal m5C mRNA’ları bildirilmiştir12. Çalışmalar, mRNA m5C modifikasyonu ve kanser bağışıklığının modülasyonu ile kanser ilerlemesi arasında bir ilişki olduğunu ortaya koymuştur13,14. Bu nedenle, mRNA üzerindeki m5C modifikasyon profilinin haritalanması, potansiyel düzenleyici mekanizmayı aydınlatmak için çok önemli bilgiler sağlayabilir.
Belirli biyolojik koşullar altında RNA m 5 C modifikasyonununfonksiyonel rollerini araştırmak için, m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq ve 5-Aza-seq gibi bisülfit dönüşüm tabanlı (bsRNA-seq) ve antikor afinite zenginleştirme tabanlı yaklaşımlar, transkriptom çapında bir ölçekte m5C modifikasyonları ile hedeflenen bölgelerin ve dizilerin verimli bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için yüksek verimli dizileme platformu ile birleştirilebilir15, 16. Bu protokolün avantajı, antikor afinitesi zenginleştirmeye dayalı yaklaşım, yüksek kaliteli antikorların mevcudiyetine dayandığından vem5C metilasyon manzarası17’nin tek parça çözünürlüğünü elde edebildiğinden, tek bazlı bir çözünürlükte kapsamlı RNA m5C manzarasını sağlar.
Tüm RNA örnekleri, oligo(dT) boncukları, üç döngü bisülfit reaksiyonu ve dizileme kütüphanesi hazırlığı kullanılarak iki tur mRNA zenginleştirme ile işlenecektir. RNA kalitesini izlemek için, her RNA numunesi, fragman dağılımını değerlendirmek için mRNA saflaştırma ve bisülfit reaksiyonu prosedürlerinden önce ve sonra kılcal jel elektroforezi ile incelenecektir. Saflaştırılmış kütüphaneler, PCR amplikon nitelikleri, kılcal jel elektroforezi ile DNA boyutu dağılım fragmanları ve dizilemeden önce floresan boya bazlı kantitatif tahlillerle incelenen toplam miktarları ile incelenecektir. Sistem ayrıca tarımsal ürünler, izole viryonlar, hücre hatları, model organizmalar ve patolojik örnekler gibi geniş bir biyolojik numune yelpazesini analiz etmek için de kullanılabilir.
Bu protokolde, standartlaştırılmış bileşenler kullanılarak ayrıntılı bir poli(A) zenginleştirme, bisülfit dönüşümü ve kütüphane hazırlama hattı elde edildi. Daha ileri dizileme analizi, ilgilenilen örneklerde mRNA 5-metilsitozinin tanımlanmasını sağladı.
Kritik adım, başlangıç materyalinin kalitesidir – toplam RNA – çünkü RNA’nın bozunması poli (A) RNA saflaştırmasının geri kazanım oranını etkileyecektir. Poli(A) RNA saflaştırma adımını gerçekle…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Tayvan Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi tarafından desteklenmiştir. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |