Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

Summary

È stato creato un sistema di perfusione epatica normotermica ex vivo (NEVLP) per i fegati di topo. Questo sistema richiede esperienza in microchirurgia, ma consente risultati di perfusione riproducibili. La capacità di utilizzare fegati di topo facilita lo studio dei percorsi molecolari per identificare nuovi additivi perfufulati e consente l'esecuzione di esperimenti incentrati sulla riparazione degli organi.

Abstract

Questo protocollo presenta un sistema NEVLP ottimizzato privo di eritrociti utilizzando fegati di topo. La conservazione ex vivo dei fegati di topo è stata ottenuta impiegando cannule modificate e tecniche adattate dalle tradizionali apparecchiature commerciali di perfusione ex vivo . Il sistema è stato utilizzato per valutare i risultati di conservazione dopo 12 ore di perfusione. I topi C57BL / 6J sono serviti come donatori di fegato e i fegati sono stati espiantati inannulando la vena porta (PV) e il dotto biliare (BD), e successivamente lavando l'organo con soluzione salina eparinizzata calda (37 ° C). Quindi, i fegati espiantati sono stati trasferiti nella camera di perfusione e sottoposti a perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I campioni di perfusato in ingresso e in uscita sono stati raccolti a intervalli di 3 ore per l'analisi del perfusato. Al termine della perfusione, sono stati ottenuti campioni di fegato per l'analisi istologica, con integrità morfologica valutata utilizzando Suzuki-Score modificato attraverso la colorazione dell'ematossilina-eosina (HE). Gli esperimenti di ottimizzazione hanno prodotto i seguenti risultati: (1) i topi di peso superiore a 30 g sono stati ritenuti più adatti per l'esperimento a causa delle maggiori dimensioni del loro dotto biliare (BD). (2) una cannula in poliuretano da 2 Fr (diametro esterno = 0,66 mm) era più adatta per l'incannulamento della vena porta (PV) rispetto a una cannula in polipropilene. Ciò è stato attribuito alla maggiore presa del materiale poliuretanico, con conseguente riduzione dello slittamento del catetere durante il trasferimento dal corpo alla camera dell'organo. (3) per l'incannulamento del dotto biliare (BD), una cannula in poliuretano da 1 Fr (diametro esterno = 0,33 mm) è risultata più efficace rispetto alla cannula in polipropilene UT - 03 (diametro esterno = 0,30 mm). Con questo protocollo ottimizzato, i fegati di topo sono stati conservati con successo per una durata di 12 ore senza un impatto significativo sulla struttura istologica. La colorazione dell'ematossilina-eosina (HE) ha rivelato un'architettura morfologica ben conservata del fegato, caratterizzata da epatociti prevalentemente vitali con nuclei chiaramente visibili e lieve dilatazione delle sinusoidi epatiche.

Introduction

Il trapianto di fegato rappresenta il trattamento gold standard per gli individui con malattia epatica allo stadio terminale. Purtroppo, la domanda di organi da donatore supera l'offerta disponibile, portando a una carenza significativa. Nel 2021, circa 24.936 pazienti erano in lista d'attesa per un trapianto di fegato, mentre solo 9.234 trapianti sono stati eseguiti con successo¹. La significativa disparità tra l'offerta e la domanda di innesti di fegato evidenzia la pressante necessità di studiare strategie alternative per ampliare il pool di donatori e migliorare l'accessibilità degli innesti di fegato. Un modo per espandere il pool di donat....

Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le attuali normative e linee guida tedesche per il benessere degli animali e le linee guida ARRIVE per la segnalazione della ricerca sugli animali. Il protocollo di sperimentazione animale è stato approvato dal Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turingia, Germania (numero di approvazione: UKJ - 17 - 106).

NOTA: I topi maschi C57BL/6J del peso di 34 ± 4 g (errore medio ± standard della media [SEM]) sono stati utilizzati come donatori di fegato. Sono stati mantenuti in condizioni ambientali controllate (50% di umidità e 18 - 23 ° C) con libero accesso a chow di topo standard e ....

Results

Istituzione della procedura chirurgica
Un totale di 17 animali sono stati utilizzati per questo esperimento: 14 topi sono stati impiegati per ottimizzare il processo di approvvigionamento degli organi, compreso l'incannulamento della vena porta (PV) e del dotto biliare (BD), mentre 3 topi sono stati utilizzati per convalidare la procedura (Tabella 1). I risultati istologici (Figura 3) sono stati confrontati per facilitare l'identificazione della condizion.......

Discussion

Passaggi critici nel protocollo
I due passaggi cruciali nell'espianto di fegato sono l'incannulamento della vena porta (PV) e il successivo incannulamento del dotto biliare (BD). Questi passaggi sono di fondamentale importanza per garantire il successo del prelievo degli organi e delle successive procedure di perfusione o trapianto.

Sfide e soluzioni
L'incannulamento fotovoltaico presenta tre sfide: lesione della parete del vaso, spostamento del catetere.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro tubo da 0,5 ml PP	Sarstedt	72699
Cannula in gomma da 1 Fr Cannula		per campioni	Vygon
10 & micro; L Micro Siringa	Hamilton	701N
2 Fr Cannula in Gomma	Vygon	Cannula
24 G Cannula a Farfalla	Terumo	SR+OF2419
26 G Cannula a Farfalla	Terumo	SR+DU2619WX
30 G Ago Ipodermico	Sterican	100246
50 ml Pompa a siringa	Braun	110356
6-0 Perma-Hand Seide	Ethicon	639H
Clip Arteriosa	Braun	BH014R
Camera Umida Autoclavabile	Hugo Sachs Elektronik	73-4733
Grande Applicatore di Cotone	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974018
Bubble Trap	Hugo-Sachs-Elektronik	V83163
Buprenovet (0,3 mg / ml)	Elanco	/
CIDEX OPA solution (2 L)	Cilag GmbH	20391
Unità elettrochirurgica per taglio monopolare VIO® 50 C	ERBE	/
Siero bovino fetale (500 ml)	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
Miscela di gas (95 % di ossigeno e 5 % di anidride carbonica)	Forniture domestiche	/
Riscaldamento Bagni circolanti	Harvard-Apparatus	75-0310
Eparina 5000 (IE / 5 ml)	Braun	1708.00.00
Idrocortisone (100 mg / 2 ml)	Pfizer	15427276
insulina (100 IE / ml)	Forbici per iride Sigma	I0516-5ML
nbsp;	Fine Science Instruments	15000-03
Isofluran (250 ml)	Cp-Pharma	1214
Ossigenatore a membrana	Hugo Sachs Elektronik	T18728
Microscopio per microchirurgia		M60
	Qualità Carfil	180000056
NanoZoomer 2.0 HT	Hamamatsu	/
Spugne non tessu	Kompressen	866110
Penicillina Streptomicina (1 mg / ml)	C.C.Pro	Z-13-M
Tubo di prolunga per perfusione (30 cm)	Braun	4256000
Pompa peristaltica	Harvard-Apparatus	P-70
Petri Dishc 100x15 mm	VWR®	391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)	Livisto	799-416
Simulatore di trasduttore di pressione	UTAH Medical Products	650-950
Trasduttori di pressione sanguigna riutilizzabili AD	Instruments	MLT-0380/D
S & Pinze per incannulamento dei vasi a T	Fine Science Instruments	00608-11
Applicatore di cotone piccolo	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974116
Pinze diritte 10 cm	Fine Science Instruments	00632-11
Pinze per legare suture	Fine Science Instruments	11063-07
Siringa 50ml Original Perfusor	Braun	8728810F-06
UT - 03 Cannula	Unique Medical, Japan	/
Vannas Spring Scissors	Fine Science Instruments	15018-10
Soluzione salina veterinaria (500 ml)	WDT	18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L	Harvard-Apparatus	73-3441
William's E Medium (500 ML)	Thermofischer Scientific	A1217601