הדמיה ארוכת טווח של אוכלוסיות עצביות מזוהות באמצעות מיקרופריזמות בבעלי חיים הנעים בחופשיות ומקובעים לראש
Summary
בשילוב עם לוחית ראש ועיצוב אופטי התואם למיקרוסקופים של פוטון בודד ושני פוטונים, עדשת המיקרופריזמה מציגה יתרון משמעותי במדידת תגובות עצביות בטור אנכי בתנאים מגוונים, כולל ניסויים מבוקרים היטב במצבים קבועים בראש או משימות התנהגותיות טבעיות בבעלי חיים הנעים בחופשיות.
Abstract
עם התקדמות המיקרוסקופ הרב-פוטוני והטכנולוגיות המולקולריות, דימות פלואורסצנטי גדל במהירות והופך לגישה רבת עוצמה לחקר המבנה, התפקוד והפלסטיות של רקמות מוח חיות. בהשוואה לאלקטרופיזיולוגיה קונבנציונלית, מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול ללכוד את הפעילות העצבית כמו גם את המורפולוגיה של התאים, ומאפשר הקלטות ארוכות טווח של אוכלוסיות הנוירונים שזוהו ברזולוציה של תא בודד או תת-תאי. עם זאת, הדמיה ברזולוציה גבוהה דורשת בדרך כלל מערך יציב וקבוע ראש המגביל את תנועת החיה, והכנת משטח שטוח של זכוכית שקופה מאפשרת הדמיה של תאי עצב במישור אופקי אחד או יותר, אך מוגבלת בחקר התהליכים האנכיים הפועלים על פני עומקים שונים. כאן, אנו מתארים הליך לשילוב קיבוע לוחית ראש ומיקרופריזמה המעניקה הדמיה רב שכבתית ורב-מודאלית. הכנה כירורגית זו לא רק מעניקה גישה לכל העמודה של קליפת המוח הראייתית של העכבר, אלא מאפשרת הדמיה של שני פוטונים במיקום קבוע בראש והדמיה של פוטון אחד בפרדיגמה הנעה בחופשיות. באמצעות גישה זו, ניתן לדגום אוכלוסיות תאים מזוהות על פני שכבות קליפת המוח השונות, לרשום את תגובותיהן תחת מצבים קבועים ונעים בחופשיות, ולעקוב אחר השינויים ארוכי הטווח לאורך חודשים. לפיכך, שיטה זו מספקת בדיקה מקיפה של microcircuits, המאפשר השוואה ישירה של פעילויות עצביות המתעוררות על ידי גירויים מבוקרים היטב תחת פרדיגמה התנהגותית טבעית.
Introduction
הופעתו של הדמיה פלואורסצנטית של שני פוטונים in vivo 1,2, המשלבת את הטכנולוגיות החדשות במערכות אופטיות ואינדיקטורים פלואורסצנטיים מהונדסים גנטית, התפתחה כטכניקה רבת עוצמה במדעי המוח לחקור את המבנה, התפקוד והפלסטיות המורכבים במוח החי 3,4. בפרט, שיטת הדמיה זו מציעה יתרון שאין שני לו על פני אלקטרופיזיולוגיה מסורתית בכך שהיא לוכדת הן את המורפולוגיה והן את הפעילות הדינמית של נוירונים, ובכך מאפשרת מעקב ארוך טווח אחר נוירונים מזוהים 5,6,7,8.
למרות חוזקותיו הראויות לציון, היישום של הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה דורש לעתים קרובות התקנה סטטית קבועה בראש המגבילה את ניידות החיה 9,10,11. בנוסף, השימוש במשטח זכוכית שקוף להדמיית תאי עצב מגביל את התצפיות למישור אופקי אחד או יותר, ומגביל את חקר הדינמיקה של תהליכים אנכיים המשתרעים על פני עומקים שונים של קליפת המוח12.
בהתייחס למגבלות אלה, המחקר הנוכחי מתווה הליך כירורגי חדשני המשלב קיבוע לוחית ראש, מיקרופריזמה ומיניסקופ ליצירת שיטת הדמיה עם יכולות רב-שכבתיות ורב-מודאליות. המיקרופריזמה מאפשרת תצפית על העיבוד האנכי לאורך עמוד קליפת המוח 13,14,15,16, שהוא קריטי להבנת האופן שבו מידע מעובד ומשתנה כשהוא נע דרך שכבות שונות של קליפת המוח וכיצד העיבוד האנכי משתנה במהלך שינויים פלסטיים. יתר על כן, הוא מאפשר הדמיה של אותן אוכלוסיות עצביות בפרדיגמה קבועה ראש ובסביבה הנעה בחופשיות, המקיפה את הגדרות הניסוי הרב-תכליתיות 17,18,19: לדוגמה, קיבוע ראש נדרש לעתים קרובות עבור פרדיגמות מבוקרות היטב כמו הערכת תפיסה חושית והקלטות יציבות תחת פרדיגמת 2 פוטונים, בעוד שתנועה חופשית מציעה סביבה טבעית וגמישה יותר למחקרים התנהגותיים. לכן, היכולת לבצע השוואה ישירה בשני המצבים חיונית לקידום הבנתנו את המיקרו-מעגלים המאפשרים תגובות גמישות ופונקציונליות.
בעיקרו של דבר, השילוב של קיבוע לוחית ראש, מיקרופריזמה ומיניסקופ בדימות פלואורסצנטי מציע פלטפורמה מבטיחה לחקירת המורכבות של מבנה המוח ותפקודו. חוקרים יכולים לדגום אוכלוסיות תאים מזוהות בעומקים שונים המשתרעים על פני כל שכבות קליפת המוח, להשוות ישירות את תגובותיהם בפרדיגמות טבעיות ומבוקרות היטב, ולנטר את השינויים ארוכי הטווח שלהם במשך חודשים20. גישה זו מציעה תובנה רבת ערך לגבי האופן שבו אוכלוסיות עצביות אלה מתקשרות ומשתנות לאורך זמן בתנאי ניסוי שונים, ומספקת חלון לטבע הדינמי של מעגלים עצביים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, הראינו את היכולת להתבונן ולהשוות ישירות תאי עצב בתנאים קבועים בראש ובתנועה חופשית באותן אוכלוסיות עצביות. בעוד הדגמנו את היישום בקליפת המוח הראייתית, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למספר רב של אזורים אחרים במוח, הן אזורים בקליפת המוח והן גרעינים עמוקים 24,25,26,27,28…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לגב’ צ’ארו רדי ולפרופסור מתאו קרנדיני (מעבדת קורטקס) על עצתם בנוגע לפרוטוקול כירורגי ושיתוף זן עכברים מהונדס. אנו מודים לד”ר נורברט הוגרפה (Inscopix) על הדרכתו וסיועו בפיתוח הניתוח. אנו מודים לגב’ אנדריאה אלדאה (Sun Lab) על עזרתה במערך הכירורגי ובעיבוד הנתונים. עבודה זו נתמכה על ידי Moorfields Eye Charity.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
Riferimenti
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
