Denne protokol beskriver høst og visualisering af elasmoide skæl af zebrafisk under in vivo regenerering. Derudover præsenteres ex vivo-kulturen af disse skalaer i op til 7 dage efter høst.
Skeletsygdomme er ofte komplekse i deres ætiologi og påvirker millioner af mennesker verden over. På grund af den aldrende befolkning er der behov for nye behandlinger, der kan lette byrden på sundhedssystemerne. Da disse sygdomme er komplekse, er det vanskeligt og dyrt at modellere knoglepatofysiologi nøjagtigt i en laboratorieindstilling. Udfordringen for feltet er at etablere en omkostningseffektiv, biologisk relevant platform til modellering af knoglesygdom, der kan bruges til at teste potentielle terapeutiske forbindelser. En sådan platform bør ideelt set tillade dynamisk visualisering af celleadfærd af knogleopbyggende osteoblaster og knoglenedbrydende osteoklaster, der virker i deres mineraliserede matrixmiljø. Zebrafisk bruges i stigende grad som modeller på grund af tilgængeligheden af genetiske værktøjer, herunder transgene reporterlinjer, og det faktum, at nogle skeletvæv (inklusive skalaerne) forbliver gennemskinnelige til voksenalderen, hvilket muliggør dynamiske billeddannelsesmuligheder. Da zebrafiskskæl har både osteoblaster og osteoklaster og er meget rigelige, giver de en let tilgængelig og rigeligt tilgængelig ressource af uafhængige knogleenheder. Desuden regenererer voksne zebrafiskskæl, når de er fjernet, fuldt ud og tilbyder derfor en måde at studere den rumlige tidsmæssige vækst af mineraliseret væv in vivo. Her beskriver vi protokoller til høst og sporing af regenerering af skalaerne. Endelig præsenteres også en protokol for stabil kultur af skalaer ex vivo i en uge og efter helingsresponsen efter kontrolleret skade på skalaens mineraliserede matrix over tid.
Knogle er et hårdt bindevæv, der udgør en stor del af skelettet, muliggør bevægelse og fungerer som en mineralreserve i kroppen. For at opretholde sunde knogler er en udsøgt balance mellem knogledannelse og nedbrydning afgørende via den koblede aktivitet af osteoblaster (som er anabolske) og osteoklaster (som resorberer knogle). Denne balance forstyrres af aldring eller hormonel ubalance, hvilket ofte fører til knoglesvaghedssygdomme som osteoporose1. Selvom eksisterende lægemidler er blevet godkendt til at målrette knoglesvaghedssygdomme, har mange bivirkninger; Derfor er der behov for nye behandlinger1. Der er således fortsat behov for rigelige kilder til biologisk relevant knoglevæv, der kan bruges til at teste potentielle terapeutiske forbindelser.
Traditionelt er gnavermodeller og cellekultursystemer blevet brugt til at studere knoglebiologi. Imidlertid bliver zebrafisk i stigende grad en anden model af valg. Selvom det ikke er et pattedyrsystem, tilbyder zebrafisk visse fordele for knogleforskning i forhold til gnavere; Disse omfatter deres fecundity og larvernes gennemskinnelighed; Selv i voksenalderen forbliver nogle skeletvæv, herunder skæl og finner, gennemsigtige, hvilket muliggør høj opløsning in vivo-billeddannelse og øget tilgængelighed af skeletmutanter 2,3. Både finner og skalaer af zebrafisk er i stand til fuldstændig regenerering efter fjernelse. Skeletregenerering og skadesreparation af zebrafiskefinner er blevet undersøgt grundigt 4,5, mens zebrafiskskæl er en nyere knoglemodel i marken, men giver fordele for ex vivo-kultur 6.
Vægte er meget rigelige, med mindst 300 skalaer på hver fisk, der tjener som et beskyttende dække for fisken. Hver skala er en lille mineraliseret plade bestående af knogledannende osteoblaster og knogleresorberende osteoklaster af en kollagenrig skeletmatrix7. Forbeningsprocessen af både zebrafiskskalaer og menneskelige knogler kræver differentiering af mesenkymale stamceller i osteoblaster for at danne den mineraliserede matrix. Zebrafiskeskæl giver en stor fordel for skeletforskning med deres stærke regenerative evne, der kan bruges til at studere knogleregenerering og reparation. På trods af tilstedeværelsen af både osteoblaster og osteoklaster mangler zebrafiskskalaer imidlertid osteocytter, der er vigtige for human knoglemodellering og mekanosensation; Den overfladiske placering af skalaerne betyder, at de let kan fjernes med et par tang. Ved fjernelse af skalaen opstår der en kaskade af begivenheder, og skalaregenerering begynder 8,9. Der er forskellige farvnings- og billeddannelsesmuligheder til rådighed for at visualisere aktiviteten af osteoblaster og osteoklaster og mineraliseringen af skalaerne, som vist i figur 1. Derudover betyder tilgængeligheden af mange relevante fluorescerende transgene reporterlinjer af zebrafisk, at man kan visualisere celledynamikken under regenerering 7,10,11. Denne proces gør det muligt at få mere forståelse af de novo knogledannelse ved at observere det tidlige mønster af skalaregenerering på fiskens flanke for at studere morfologi, cellulær aktivitet og genetiske profiler af disse regenererede skalaer. Biologien bag skaladannelse og regenerering er blevet godt karakteriseret. Det er vigtigt, at skalaer kan vise en god prædiktiv evne til terapeutisk relevante forbindelser12, og behandling af fisk med glukokortikoider fører til en skala, der regenererer for at vise osteoporotiske fænotyper13. Transskriptomet af de regenererende skalaer viser, at gener, der aktiveres i skalaregenerering, beriges for dem, der er knyttet til menneskelige skeletsygdomme, hvilket yderligere demonstrerer deres relevans som et modelsystem 6,14.
Endelig kan disse skalaer dyrkes ex vivo i op til 7 dage. Sammenlignet med cellelinjekulturer, der typisk består af en enkelt celletype, giver ex vivo-skalakultur in vitro-knogleundersøgelsesmuligheder inden for sit naturlige miljø, der indeholder både osteoblaster og osteoklaster med sin naturlige ekstracellulære matrix 8,12,15,16.
Skalakultur giver os også mulighed for at udføre lægemiddelscreening for nye osteoanabolske mål. Overfloden af skalaer på fisken betyder, at man kan fylde mindst to plader af 96-brøndpladen fra kun en enkelt fisk, hvilket giver mulighed for sammensat screening i et multiwell-format, hvor hver enkelt brønd indeholder en skala sammen med sin naturlige niche af celler. Da skalaerne desuden er tynde, er lægemiddelabsorptionen forudsigelig12. Sammenfattende har zebrafiskens elasmoide skæl et stort potentiale i skeletforskning og kan hjælpe os med at få mere indsigt i de cellulære begivenheder under knogledannelse og reparation. Her beskriver vi protokoller for høstskalaer for at følge regenerering in vivo og dyrke skalaerne ex vivo.
Zebrafiskens elasmoide skæl, som en ny model for skeletforskning, har et stort potentiale til at hjælpe vores forståelse af knoglevedligeholdelse, regenerering og skadereparation. Overfloden af skalaer på fisk giver mulighed for medium til høj kapacitet sammensat screening, samtidig med at antallet af anvendte dyr reduceres og begrænses intra-individuel variation. Her præsenteres protokoller for skalaregenerering og ex vivo-skalakultur for at studere regenerering og reparation.
Nogle kritiske trin skal overvejes, når du følger denne protokol. Omhyggelig fjernelse af skalaerne er afgørende, især når man bruger en transgen reporterlinje for at begrænse forstyrrelsen af cellepopulationen forårsaget af høst. Hvis der skal foretages sammenligninger med ontogenetiske skalaer, skal du sikre dig, at regionen ikke indeholder spontant regenererende skalaer (som naturligt kan forekomme gennem fiskens levetid). Sørg for, at miljøet og udstyret er sterilt til ex vivo-kultur for at opnå optimal celleoverlevelse og minimal infektion i kultur.
Afhængigt af det specifikke forskningsspørgsmål kan der foretages tilpasninger til protokollen, såsom at kombinere forskellige transgene reporterlinjer for at visualisere andre celletyper af genekspressionsprofiler under regenerering og reparation11,14.
Den brede vifte af farvning, man kan udføre på skalaerne, betyder, at man for hver testet forbindelse eller tilstand kan se på dens virkninger på knoglen fra forskellige vinkler; mens sp7 / osx-journalister kan vise osteoblastnumre, ALP-farvning kan visualisere osteoblastaktivitet, TRAP-farvning kan visualisere osteoklastaktivitet, Calcein-grøn levende farvning kan mærke nydannende knogle og Alizarin-rød eller von Kossa-farvning kan vise mineralisering i skala. Luciferaseaktivitet til kvantificering af osteoblaster kan også anvendes12. Kombineret med disse farvningsteknikker kan man lære det relative bidrag fra osteoblaster og osteoklaster til en given knogleeffekt. Vægte mangler osteocytter, som er udbredt i pattedyrs knogler og er de vigtigste drivkræfter for knoglemekanosensorisk respons; Skalareparation og regenerering i denne model er primært drevet af osteoblaster med efterfølgende ombygning af osteoklaster 8,9. Det er afgørende at bemærke, at der forekommer variation mellem individer og aldersgrupper20. For at minimere dette skal skalaens høstareal være konstant, da forskellige placeringer kan give anledning til forskellige skalamorfologier, og fisk fra de samme søskendegrupper bruges, så alder og størrelse er konsistente. Men fordi der kan høstes flere skalaer pr. Fisk, kan man køre flere eksperimenter med færre fisk, hvilket reducerer variationen inden for individet.
Sammenfattende viser disse protokoller eksperimentelle teknikker, der kan anvendes på ontogenetiske og regenererende skalaer. Afslutningsvis viser elasmoidskalaer stort potentiale som skeletmodel til at hjælpe forståelsen af knogledannelse og reparation; og vil bidrage til at reducere brugen af dyr til screening af osteoanabolske forbindelser med høj kapacitet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Mathew Green fra Animal Service Unit for fiskehold og Katy Jepson fra Wolfson Bioimaging Centre. CLH, DB og QT blev finansieret af Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB og QT Intermediate Fellowship 22044), RR blev finansieret af (NHMRC APP1158758). Dette arbejde blev også støttet af BBSRC-tilskuddet (BB/T001984/1).
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
Alizarin red | Sigma | A5533 | |
Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
Calcein powder | Sigma | C0875 | |
Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
Cover slips | VWR | 631-0146 | |
Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
Danieau | Sigma | ||
DMEM | Life Technologies | 31053 | |
Falcon tubes | Corning | 430828 | |
Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
Glycerol | Sigma | 81381 | |
Hepes | Sigma | H3375 | |
Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
MQ water | X | ||
N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
Tris | Sigma | 252859 | |
Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L – 28 cm x 11 cm x 17 cm |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L – 28 cm x 7 cm x 11 cm |