यह प्रोटोकॉल विवो पुनर्जनन के दौरान जेब्राफिश के इलास्मोइड तराजू की कटाई और दृश्य का वर्णन करता है। इसके अलावा, फसल के बाद 7 दिनों तक इन तराजू की पूर्व विवो संस्कृति प्रस्तुत की जाती है।
कंकाल रोग अक्सर उनके एटियलजि में जटिल होते हैं और दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करते हैं। उम्र बढ़ने की आबादी के कारण, नए उपचारों की आवश्यकता है जो स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों पर बोझ को कम कर सकें। चूंकि ये रोग जटिल हैं, इसलिए प्रयोगशाला सेटिंग में हड्डी के पैथोफिज़ियोलॉजी को सटीक रूप से मॉडल करना मुश्किल और महंगा है। क्षेत्र के लिए चुनौती हड्डी रोग मॉडलिंग के लिए एक लागत प्रभावी, जैविक रूप से प्रासंगिक मंच स्थापित करना है जिसका उपयोग संभावित चिकित्सीय यौगिकों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह के एक मंच को आदर्श रूप से हड्डी-निर्माण ओस्टियोब्लास्ट के सेल व्यवहार के गतिशील दृश्य और उनके खनिज मैट्रिक्स वातावरण में अभिनय करने वाले हड्डी-अपमानजनक ऑस्टियोक्लास्ट की अनुमति देनी चाहिए। ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों सहित आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता के कारण ज़ेब्राफिश को मॉडल के रूप में तेजी से उपयोग किया जाता है, और तथ्य यह है कि कुछ कंकाल ऊतक (तराजू सहित) वयस्कता के लिए पारभासी रहते हैं, जिससे गतिशील इमेजिंग विकल्प मिलते हैं। चूंकि ज़ेब्राफिश तराजू में ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों होते हैं और अत्यधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं, इसलिए वे स्वतंत्र हड्डी इकाइयों का आसानी से सुलभ और प्रचुर मात्रा में उपलब्ध संसाधन प्रदान करते हैं। इसके अलावा, एक बार हटा दिए जाने के बाद, वयस्क ज़ेब्राफिश तराजू पूरी तरह से पुनर्जीवित हो जाते हैं, इसलिए विवो में खनिज ऊतक के स्थानिक विकास का अध्ययन करने का एक तरीका प्रदान करते हैं।यहां, हम तराजू के पुनर्जनन की कटाई और ट्रैकिंग के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। अंत में, एक सप्ताह के लिए तराजू पूर्व vivo की स्थिर संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल और समय के साथ पैमाने के खनिज मैट्रिक्स को नियंत्रित क्षति के बाद चिकित्सा प्रतिक्रिया के बाद भी प्रस्तुत किया जाता है.
हड्डी एक कठोर संयोजी ऊतक है जो कंकाल का एक प्रमुख हिस्सा बनाता है, जो हरकत को सक्षम करता है और शरीर में खनिज आरक्षित के रूप में कार्य करता है। स्वस्थ हड्डी को बनाए रखने के लिए, हड्डी के गठन और गिरावट के बीच एक उत्कृष्ट संतुलन ओस्टियोब्लास्ट्स (जो उपचय हैं) और ओस्टियोक्लास्ट (जो हड्डी को पुनर्जीवित करता है) की युग्मित गतिविधि के माध्यम से आवश्यक है। यह संतुलन उम्र बढ़ने या हार्मोनल असंतुलन से बाधित होता है, जो अक्सर ऑस्टियोपोरोसिसजैसे हड्डियों की नाजुकता रोगों का कारण बनता है। हालांकि मौजूदा दवाओं को हड्डी की नाजुकता रोगों को लक्षित करने के लिए अनुमोदित किया गया है, कई के दुष्प्रभाव हैं; इसलिए, नए चिकित्सा विज्ञान की आवश्यकता है1. इस प्रकार, जैविक रूप से प्रासंगिक हड्डी के ऊतकों के प्रचुर स्रोतों की आवश्यकता बनी हुई है जिनका उपयोग संभावित चिकित्सीय यौगिकों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
परंपरागत रूप से, हड्डी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए कृंतक मॉडल और सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग किया गया है। हालांकि, ज़ेब्राफिश तेजी से पसंद का एक और मॉडल बन रही है। जबकि एक स्तनधारी प्रणाली नहीं है, ज़ेब्राफिश कृन्तकों पर हड्डी अनुसंधान के लिए कुछ फायदे प्रदान करते हैं; इनमें उनकी उर्वरता और लार्वा की पारभासी शामिल है; वयस्कता में भी, तराजू और पंख सहित कुछ कंकाल ऊतक, पारभासी रहते हैं, विवो इमेजिंग में उच्च-रिज़ॉल्यूशन और कंकाल म्यूटेंट 2,3 की उपलब्धता में वृद्धि की अनुमति देते हैं। ज़ेब्राफिश के पंख और तराजू दोनों हटाने के बाद पूर्ण पुनर्जनन में सक्षम हैं। कंकाल पुनर्जनन और जेब्राफिश पंख की चोट की मरम्मत बड़े पैमाने पर 4,5 अध्ययन किया गया है, जबकि zebrafish तराजू क्षेत्र में एक नया हड्डी मॉडल हैं, लेकिन पूर्व विवो संस्कृति6 के लिए लाभ प्रदान करते हैं.
तराजू अत्यधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं, प्रत्येक मछली पर कम से कम 300 तराजू होते हैं जो मछली के लिए सुरक्षात्मक आवरण के रूप में काम करते हैं। प्रत्येक पैमाना एक छोटी खनिज प्लेट है जिसमें हड्डी बनाने वाले ओस्टियोब्लास्ट और कोलेजन युक्त कंकाल मैट्रिक्स7 के हड्डी-पुनर्जीवन ओस्टियोक्लास्ट शामिल हैं। जेब्राफिश तराजू और मानव हड्डियों दोनों की अस्थिभंग प्रक्रिया को खनिज मैट्रिक्स बनाने के लिए ओस्टियोब्लास्ट में मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव की आवश्यकता होती है। ज़ेब्राफिश तराजू अपनी मजबूत पुनर्योजी क्षमता के साथ कंकाल अनुसंधान के लिए एक बड़ा लाभ प्रदान करते हैं जिसका उपयोग हड्डी पुनर्जनन और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों की उपस्थिति के बावजूद, ज़ेब्राफिश तराजू में ऑस्टियोसाइट्स की कमी होती है जो मानव हड्डी रीमॉडेलिंग और मैकेनोसेंसेशन के लिए महत्वपूर्ण हैं; तराजू के सतही स्थान का मतलब है कि वे आसानी से संदंश की एक जोड़ी के साथ हटाया जा सकता है. पैमाने को हटाने पर, घटनाओं का एक झरना होता है, और पैमाने पर उत्थान 8,9 शुरू होता है. ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट्स की गतिविधि और तराजू के खनिजकरण की कल्पना करने के लिए विभिन्न धुंधला और इमेजिंग विकल्प उपलब्ध हैं, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, ज़ेब्राफिश के कई प्रासंगिक फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों की उपलब्धता का मतलब है कि कोई पुनर्जनन 7,10,11के दौरान सेल गतिशीलता की कल्पना कर सकता है। यह प्रक्रिया आकृति विज्ञान, सेलुलर गतिविधि और इन पुनर्जीवित तराजू के आनुवंशिक प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए मछली के किनारे पर पैमाने के उत्थान के शुरुआती पैटर्निंग को देखकर डी नोवो हड्डी के गठन की अधिक समझ हासिल करने की अनुमति देती है। पैमाने के गठन और उत्थान के जीव विज्ञान को अच्छी तरह से चित्रित किया गया है। महत्वपूर्ण बात, तराजू चिकित्सीय प्रासंगिक यौगिकों12 के लिए एक अच्छा भविष्य कहनेवाला क्षमता दिखा सकते हैं और glucocorticoids के साथ मछली के उपचार ऑस्टियोपोरोटिक phenotypes13 दिखाने के लिए regenerate करता है कि एक पैमाने की ओर जाता है. पुनर्जीवित तराजू के प्रतिलेख से पता चलता है कि पैमाने पर पुनर्जनन में सक्रिय जीन मानव कंकाल रोगों से जुड़े लोगों के लिए समृद्ध हैं, आगे एक मॉडल प्रणाली 6,14 के रूप में उनकी प्रासंगिकता का प्रदर्शन.
अंत में, इन पैमानों को 7 दिनों तक पूर्व विवो सुसंस्कृत किया जा सकता है। सेल लाइन संस्कृतियों की तुलना में जो आम तौर पर एक एकल सेल प्रकार से बने होते हैं, पूर्व विवो स्केल संस्कृति अपने प्राकृतिक वातावरण के भीतर इन विट्रो हड्डी अध्ययन के अवसरों में प्रदान करती है जिसमें ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों अपने प्राकृतिक बाह्य मैट्रिक्स 8,12,15,16 के साथ होते हैं।
स्केल संस्कृति हमें उपन्यास ऑस्टियोएनाबॉलिक लक्ष्यों के लिए दवा स्क्रीनिंग करने की भी अनुमति देती है। मछली पर तराजू की बहुतायत का मतलब है कि एक ही मछली से 96 अच्छी तरह से थाली के कम से कम दो प्लेटों को भर सकते हैं, एक multiwell प्रारूप में यौगिक स्क्रीनिंग के लिए अनुमति जहां हर एक अच्छी तरह से कोशिकाओं के अपने प्राकृतिक आला के साथ एक पैमाने होते हैं. इसके अतिरिक्त, चूंकि तराजू पतले हैं, इसलिए दवा अवशोषणअनुमानित 12 है। सारांश में, ज़ेब्राफिश के इलास्मोइड तराजू में कंकाल अनुसंधान में काफी संभावनाएं हैं और हड्डी के गठन और मरम्मत के दौरान सेलुलर घटनाओं में अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में हमारी सहायता कर सकते हैं। यहां, हम विवो में पुनर्जनन का पालन करने के लिए कटाई तराजू के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और तराजू पूर्व विवो की संस्कृति करते हैं।
कंकाल अनुसंधान के लिए एक उपन्यास मॉडल के रूप में ज़ेब्राफिश के इलास्मोइड तराजू, हड्डी के रखरखाव, पुनर्जनन और चोट की मरम्मत की हमारी समझ में मदद करने के लिए काफी क्षमता रखते हैं। मछली पर तराजू की प्रचुरता मध्यम से उच्च-थ्रूपुट यौगिक स्क्रीनिंग की अनुमति देती है, जबकि उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करती है और अंतर-व्यक्तिगत भिन्नता को सीमित करती है। यहां, पुनर्जनन और पूर्व विवो स्केल संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल पुनर्जनन और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं।
इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर विचार करने की आवश्यकता है। तराजू का सावधानीपूर्वक निष्कासन आवश्यक है, खासकर जब कटाई के कारण सेल आबादी में गड़बड़ी को सीमित करने के लिए ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन का उपयोग करना। यदि तुलना ऑन्टोजेनेटिक तराजू से की जानी है, तो सुनिश्चित करें कि इस क्षेत्र में अनायास पुनर्जीवित तराजू नहीं हैं (जो स्वाभाविक रूप से मछली के जीवनकाल के माध्यम से हो सकता है)। सुनिश्चित करें कि पर्यावरण और उपकरण पूर्व विवो संस्कृति के लिए इष्टतम सेल अस्तित्व और संस्कृति में न्यूनतम संक्रमण प्राप्त करने के लिए बाँझ हैं।
विशिष्ट शोध प्रश्न के आधार पर, पुनर्जनन औरमरम्मत 11,14 के दौरान जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के अन्य सेल प्रकारों की कल्पना करने के लिए विभिन्न ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों के संयोजन के रूप में प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलन किया जा सकता है।
धुंधला होने की विस्तृत श्रृंखला तराजू पर प्रदर्शन कर सकती है इसका मतलब है कि प्रत्येक परीक्षण किए गए यौगिक या स्थिति के लिए कोई भी विभिन्न कोणों से हड्डी पर इसके प्रभावों को देख सकता है; जबकि एसपी 7 / ओएसएक्स रिपोर्टर ओस्टियोब्लास्ट नंबर दिखा सकते हैं, एएलपी धुंधला ओस्टियोब्लास्ट गतिविधि की कल्पना कर सकता है, ट्रैप धुंधला ओस्टियोक्लास्ट गतिविधि की कल्पना कर सकता है, कैल्सिन ग्रीन लाइव धुंधला नव गठन हड्डी और अलीज़रीन लाल या वॉन कोसा धुंधला पैमाने पर खनिज दिखा सकता है। ओस्टियोब्लास्ट की मात्रा निर्धारित करने के लिए लूसीफ़ेरेज़ गतिविधि का उपयोग12 भी किया जा सकता है। इन धुंधला तकनीकों के साथ संयुक्त, कोई भी किसी दिए गए हड्डी प्रभाव के लिए ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट के सापेक्ष योगदान को सीख सकता है। तराजू में ऑस्टियोसाइट्स की कमी होती है, जो स्तनधारी हड्डी में प्रचलित हैं और हड्डी मेकेनोसेंसरी प्रतिक्रिया के मुख्य चालक हैं; इस मॉडल में स्केल मरम्मत और उत्थान मुख्य रूप से ओस्टियोक्लास्ट 8,9 द्वारा बाद के रीमॉडेलिंग के साथ ओस्टियोब्लास्ट द्वारा संचालित होते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि व्यक्तियों और आयु समूहों के बीच भिन्नताहोती है। इसे कम करने के लिए, स्केल फसल क्षेत्र स्थिर होना चाहिए, क्योंकि विभिन्न स्थान अलग-अलग पैमाने की आकृति विज्ञान को जन्म दे सकते हैं, और एक ही भाई-बहन समूहों की मछली का उपयोग किया जाता है ताकि उम्र और आकार सुसंगत हों। हालांकि, क्योंकि प्रति मछली कई तराजू काटा जा सकता है, कोई भी कम मछली का उपयोग करके अधिक प्रयोग चला सकता है, जिससे अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता कम हो जाती है।
सारांश में, इन प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक तकनीकों है कि ontogenetic और पुनर्जीवित तराजू के लिए लागू किया जा सकता है दिखा. अंत में, इलास्मोइड तराजू हड्डी के गठन और मरम्मत की समझ में सहायता के लिए एक कंकाल मॉडल के रूप में बड़ी क्षमता दिखाते हैं; और उच्च थ्रूपुट ऑस्टियोएनाबॉलिक यौगिक स्क्रीनिंग के लिए पशु उपयोग को कम करने में मदद करेगा।
The authors have nothing to disclose.
हम मछली पालन के लिए पशु सेवा इकाई के मैथ्यू ग्रीन और वोल्फसन बायोइमेजिंग सेंटर से कैटी जेपसन को धन्यवाद देना चाहते हैं। सीएलएच, डीबी और क्यूटी को बनाम गठिया (सीएलएच सीनियर फैलोशिप 21937, डीबी और क्यूटी इंटरमीडिएट फैलोशिप 22044) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, आरआर को (एनएचएमआरसी APP1158758) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। इस काम को BBSRC अनुदान (BB/T001984/1) द्वारा भी समर्थित किया गया था।
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
Alizarin red | Sigma | A5533 | |
Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
Calcein powder | Sigma | C0875 | |
Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
Cover slips | VWR | 631-0146 | |
Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
Danieau | Sigma | ||
DMEM | Life Technologies | 31053 | |
Falcon tubes | Corning | 430828 | |
Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
Glycerol | Sigma | 81381 | |
Hepes | Sigma | H3375 | |
Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
MQ water | X | ||
N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
Tris | Sigma | 252859 | |
Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L – 28 cm x 11 cm x 17 cm |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L – 28 cm x 7 cm x 11 cm |