이 프로토콜은 in vivo 재생 중 제브라피쉬의 엘라스모이드 비늘을 채취하고 시각화하는 방법을 설명합니다. 또한, 수확 후 최대 7일 동안 이러한 스케일의 생체 외 배양이 제시됩니다.
골격계 질환은 종종 그 원인이 복잡하며 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미칩니다. 인구 고령화로 인해 의료 시스템의 부담을 덜어줄 수 있는 새로운 치료법이 필요합니다. 이러한 질병은 복잡하기 때문에 실험실 환경에서 뼈 병태생리학을 정확하게 모델링하는 것은 어렵고 비용이 많이 듭니다. 이 분야의 과제는 잠재적인 치료 화합물을 테스트하는 데 사용할 수 있는 뼈 질환 모델링을 위한 비용 효율적이고 생물학적으로 관련된 플랫폼을 구축하는 것입니다. 이러한 플랫폼은 광물화된 매트릭스 환경에서 활동하는 뼈 형성 조골세포와 뼈 분해 파골세포의 세포 거동을 동적으로 시각화할 수 있어야 합니다. 제브라피쉬는 형질전환 리포터 라인을 포함한 유전 도구의 가용성과 일부 골격 조직(비늘 포함)이 성충이 될 때까지 반투명하게 유지되어 동적 이미징 옵션을 허용한다는 사실로 인해 모델로 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 제브라피시 비늘은 조골세포와 파골세포를 모두 가지고 있고 매우 풍부하기 때문에 쉽게 접근할 수 있고 풍부하게 사용할 수 있는 독립적인 뼈 단위의 자원을 제공합니다. 또한, 일단 제거되면 성인 제브라피시 비늘은 완전히 재생되므로 생체 내에서 광물화된 조직의 시공간 성장을 연구할 수 있는 방법을 제공합니다.여기에서는 비늘의 재생을 수확하고 추적하기 위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 마지막으로, 일주일 동안 생체 외 비늘의 안정적인 배양 및 시간 경과에 따른 저울의 광물화된 매트릭스에 대한 통제된 손상 후 치유 반응에 대한 프로토콜도 제시됩니다.
뼈는 골격의 주요 부분을 형성하는 단단한 결합 조직으로, 운동을 가능하게 하고 신체의 미네랄 저장고 역할을 합니다. 건강한 뼈를 유지하기 위해서는 조골세포(단백동화)와 파골세포(뼈를 재흡수)의 결합 활동을 통해 뼈 형성과 퇴화 사이의 절묘한 균형이 필수적입니다. 이러한 균형은 노화나 호르몬 불균형으로 인해 깨지며, 종종 골다공증과 같은 뼈 취약성 질환을 유발한다1. 기존 약물은 뼈 취약성 질환을 표적으로 하는 것으로 승인되었지만 많은 약물이 부작용을 가지고 있습니다. 따라서 새로운 치료제가 필요하다1. 따라서 잠재적인 치료 화합물을 테스트하는 데 사용할 수 있는 생물학적으로 관련된 뼈 조직의 풍부한 공급원에 대한 필요성이 남아 있습니다.
전통적으로 설치류 모델과 세포 배양 시스템은 뼈 생물학을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나 제브라피시는 점점 더 선택의 대상이 되고 있습니다. 포유류 시스템은 아니지만 제브라피쉬는 설치류에 비해 뼈 연구에 특정 이점을 제공합니다. 여기에는 번식력과 유충의 반투명도가 포함됩니다. 성인이 되어서도 비늘과 지느러미를 포함한 일부 골격 조직은 반투명하게 유지되어 고해상도 생체 내 이미징이 가능하고 골격 돌연변이 2,3의 가용성이 증가합니다. 제브라피쉬의 지느러미와 비늘은 모두 제거 후 완전히 재생될 수 있습니다. 제브라피시 지느러미의 골격 재생 및 부상 복구는 광범위하게 연구되어 왔으며4,5 제브라피시 비늘은 현장에서 가장 새로운 뼈 모델이지만 체외 배양에 이점을 제공한다6.
비늘은 매우 풍부하며 각 물고기에는 물고기를 보호하는 덮개 역할을 하는 최소 300개의 비늘이 있습니다. 각 비늘은 콜라겐이 풍부한 골격 기질(skeletal matrix)의 뼈를 형성하는 조골세포(osteoblast)와 뼈를 흡수하는 파골세포(bone-resoring osteoclast)로 구성된 작은 광물화된 판이다(7). 제브라피시 비늘과 인간 뼈의 골화 과정은 중간엽 줄기세포를 조골세포로 분화시켜 광물화된 기질을 형성해야 합니다. 제브라피시 비늘은 뼈 재생 및 복구를 연구하는 데 사용할 수 있는 강력한 재생 능력으로 골격 연구에 큰 이점을 제공합니다. 그러나 조골세포와 파골세포가 모두 존재함에도 불구하고 제브라피시 비늘에는 인간의 뼈 리모델링과 기계 감각에 중요한 골세포가 없습니다. 비늘의 표면 위치는 한 쌍의 집게로 쉽게 제거할 수 있음을 의미합니다. 스케일을 제거하면 일련의 이벤트가 발생하고 스케일 재생이 시작됩니다 8,9. 그림 1과 같이 조골세포와 파골세포의 활동과 비늘의 광물화를 시각화하는 데 사용할 수 있는 다양한 염색 및 이미징 옵션이 있습니다. 또한, 제브라피쉬의 많은 관련 형광 형질전환 리포터 라인을 사용할 수 있다는 것은 재생 중 세포 역학을 시각화할 수 있다는 것을 의미합니다 7,10,11. 이 과정을 통해 물고기 옆구리의 비늘 재생의 초기 패턴을 관찰하여 이러한 재생된 비늘의 형태, 세포 활동 및 유전적 프로필을 연구함으로써 새로운 뼈 형성에 대해 더 잘 이해할 수 있습니다. 스케일 형성 및 재생의 생물학은 잘 특성화되어 있습니다. 중요한 것은, 비늘은 치료적으로 관련된 화합물에 대한 우수한 예측 능력을 나타낼 수 있으며12 글루코코르티코이드로 어류를 처리하면 골다공증성 표현형을 보여주기 위해 재생성되는 저울로 이어진다13. 재생 스케일의 전사체는 스케일 재생에서 활성화된 유전자가 인간 골격계 질환과 관련된 유전자에 대해 풍부하다는 것을 보여주며, 모델 시스템으로서의 관련성을 더욱 입증합니다 6,14.
마지막으로, 이러한 비늘은 최대 7일 동안 생체 외에서 배양할 수 있습니다. 일반적으로 단일 세포 유형으로 구성된 세포주 배양과 비교하여 체외 규모 배양은 자연 세포외 기질 8,12,15,16을 가진 조골세포와 파골세포를 모두 포함하는 자연 환경 내에서 체외 뼈 연구 기회를 제공합니다.
스케일 배양은 또한 새로운 골동화 작용 표적에 대한 약물 스크리닝을 수행할 수 있도록 합니다. 물고기에 비늘이 풍부하다는 것은 물고기 한 마리에서 96웰 플레이트의 플레이트를 최소 2개 이상 채울 수 있다는 것을 의미하며, 모든 단일 웰에 세포의 자연스러운 틈새와 함께 하나의 스케일이 포함된 멀티웰 형식의 복합 스크리닝이 가능합니다. 또한, 비늘이 얇기 때문에 약물 흡수를 예측할 수 있다12. 요약하면, 제브라피쉬의 엘라스모이드 비늘은 골격 연구에서 큰 잠재력을 가지고 있으며 뼈 형성 및 복구 중 세포 이벤트에 대한 더 많은 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서는 생체 내 재생을 따르기 위한 비늘 수확 프로토콜과 생체 외 배양 비늘에 대해 설명합니다.
제브라피쉬의 엘라스모이드 비늘은 골격 연구를 위한 새로운 모델로서 뼈 유지, 재생 및 부상 복구에 대한 우리의 이해를 도울 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 물고기에 비늘이 풍부하기 때문에 중처리량에서 고처리량의 화합물 스크리닝이 가능하며, 사용되는 동물의 수를 줄이고 개체 내 변동을 제한할 수 있습니다. 여기에서는 재생 및 복구를 연구하기 위해 스케일 재생 및 체외 스케일 배양을 위한 프로토콜을 제시합니다.
이 프로토콜을 따를 때 몇 가지 중요한 단계를 고려해야 합니다. 비늘을 조심스럽게 제거하는 것은 필수적이며, 특히 형질전환 리포터 라인을 사용하여 수확으로 인한 세포 집단에 대한 교란을 제한할 때 더욱 그렇습니다. 존재 유전 학적 규모와 비교하려면 해당 영역에 자연 재생 비늘 (물고기의 수명 동안 자연적으로 발생할 수 있음)이 포함되어 있지 않은지 확인하십시오. 최적의 세포 생존과 배양 내 감염 최소화를 달성하기 위해 체외 배양을 위한 환경과 장비를 멸균 상태로 유지합니다.
특정 연구 질문에 따라, 재생 및 복구 동안 다른 세포 유형의 유전자 발현 프로파일을 시각화하기 위해 상이한 형질전환 리포터 라인을 결합하는 것과 같은 프로토콜에 대한 적응이 이루어질 수 있습니다11,14.
저울에서 수행할 수 있는 염색의 범위가 넓다는 것은 테스트된 각 화합물 또는 조건에 대해 다양한 각도에서 뼈에 미치는 영향을 볼 수 있음을 의미합니다. sp7/osx 리포터는 조골세포 수를 표시할 수 있고, ALP 염색은 조골세포 활성을 시각화할 수 있으며, TRAP 염색은 파골세포 활성을 시각화할 수 있으며, Calcein green 라이브 염색은 새로 형성되는 뼈를 라벨링할 수 있으며, Alizarin red 또는 von Kossa 염색은 스케일 광물화를 표시할 수 있습니다. 조골세포를 정량화하기 위한 루시페라아제 활성도 사용할 수 있다12. 이러한 염색 기법과 결합하면 주어진 뼈 효과에 대한 조골세포와 파골세포의 상대적 기여도를 알 수 있습니다. 비늘에는 포유류 뼈에 널리 퍼져 있는 골세포가 부족하며 뼈 기계 감각 반응의 주요 동인입니다. 이 모델에서 스케일 복구 및 재생은 주로 조골세포에 의해 구동되며 후속 리모델링은 파골세포에 의해 구동됩니다 8,9. 개인과 연령 그룹 간에 차이가 발생한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다20. 이를 최소화하기 위해서는 위치에 따라 비늘 형태가 달라질 수 있기 때문에 비늘 채취 면적이 일정해야 하며, 나이와 크기가 일정하도록 동일한 형제 그룹의 물고기를 사용합니다. 그러나 물고기당 여러 개의 비늘을 수확할 수 있기 때문에 더 적은 수의 물고기를 사용하여 더 많은 실험을 실행할 수 있어 개체 내 변동성을 줄일 수 있습니다.
요약하면, 이러한 프로토콜은 존재 유전 및 재생 규모에 적용 할 수있는 실험 기술을 보여줍니다. 결론적으로, 엘라스모이드 비늘은 뼈 형성 및 복구에 대한 이해를 돕기 위해 골격 모델로서 큰 잠재력을 보여줍니다. 고처리량 골동화 화합물 스크리닝을 위한 동물 사용을 줄이는 데 도움이 됩니다.
The authors have nothing to disclose.
어류 사육을 위한 동물 서비스 부서의 매튜 그린(Mathew Green)과 울프슨 바이오이미징 센터(Wolfson Bioimaging Centre)의 케이티 젭슨(Katy Jepson)에게 감사의 뜻을 전합니다. CLH, DB 및 QT는 Versus Arthritis(CLH Senior Fellowship 21937, DB and QT Intermediate Fellowship 22044)에서 자금을 지원했으며 RR은 (NHMRC APP1158758)에서 자금을 지원했습니다. 이 작업은 BBSRC 보조금(BB/T001984/1)의 지원도 받았습니다.
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
Alizarin red | Sigma | A5533 | |
Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
Calcein powder | Sigma | C0875 | |
Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
Cover slips | VWR | 631-0146 | |
Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
Danieau | Sigma | ||
DMEM | Life Technologies | 31053 | |
Falcon tubes | Corning | 430828 | |
Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
Glycerol | Sigma | 81381 | |
Hepes | Sigma | H3375 | |
Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
MQ water | X | ||
N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
Tris | Sigma | 252859 | |
Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L – 28 cm x 11 cm x 17 cm |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L – 28 cm x 7 cm x 11 cm |