Denne protokollen beskriver høsting og visualisering av elasmoide skjell av sebrafisk under in vivo regenerering. I tillegg presenteres ex vivo-kulturen av disse skalaene i opptil 7 dager etter høsting.
Skjelettsykdommer er ofte komplekse i sin etiologi og påvirker millioner av mennesker over hele verden. På grunn av den aldrende befolkningen er det behov for nye terapier som kan lette byrden på helsevesenet. Siden disse sykdommene er komplekse, er det vanskelig og dyrt å nøyaktig modellere beinpatofysiologi i en laboratorieinnstilling. Utfordringen for feltet er å etablere en kostnadseffektiv, biologisk relevant plattform for modellering av beinsykdom som kan brukes til å teste potensielle terapeutiske forbindelser. En slik plattform bør ideelt sett tillate dynamisk visualisering av celleadferd av beinbyggende osteoblaster og beinnedbrytende osteoklaster som virker i deres mineraliserte matriksmiljø. Sebrafisk brukes i økende grad som modeller på grunn av tilgjengeligheten av genetiske verktøy, inkludert transgene reporterlinjer, og det faktum at noen skjelettvev (inkludert skalaene) forblir gjennomsiktige til voksen alder, noe som tillater dynamiske bildebehandlingsalternativer. Siden sebrafiskskalaer har både osteoblaster og osteoklaster og er svært rikelige, gir de en lett tilgjengelig og rikelig tilgjengelig ressurs av uavhengige beinenheter. Dessuten, når de er fjernet, regenererer voksne sebrafiskskalaer fullstendig, og tilbyr derfor en måte å studere spatiotemporal vekst av mineralisert vev in vivo. Her beskriver vi protokoller for høsting og sporing av regenerering av skalaene. Til slutt presenteres også en protokoll for stabil kultur av skalaer ex vivo i en uke og etter helbredelsesresponsen etter kontrollert skade på den mineraliserte matrisen av skalaen over tid.
Ben er et hardt bindevev som utgjør en stor del av skjelettet, som muliggjør bevegelse og fungerer som et mineralreservat i kroppen. For å opprettholde sunt bein, er en utsøkt balanse mellom beindannelse og nedbrytning viktig via den koblede aktiviteten til osteoblaster (som er anabole) og osteoklaster (som resorberer bein). Denne balansen forstyrres av aldring eller hormonell ubalanse, noe som ofte fører til benfraghetssykdommer som osteoporose1. Selv om eksisterende medisiner har blitt godkjent for å målrette benfraghetssykdommer, har mange bivirkninger; Derfor er det behov for ny behandling1. Dermed er det fortsatt behov for rikelig med kilder til biologisk relevant beinvev som kan brukes til å teste potensielle terapeutiske forbindelser.
Tradisjonelt har gnagermodeller og cellekultursystemer blitt brukt til å studere beinbiologi. Imidlertid blir sebrafisk i økende grad en annen modell av valg. Selv om det ikke er et pattedyrsystem, gir sebrafisk visse fordeler for beinforskning i forhold til gnagere; Disse inkluderer deres fecundity og gjennomskinnelighet av larver; Selv i voksen alder forblir noen skjelettvev, inkludert skalaene og finnene, gjennomskinnelige, noe som muliggjør høyoppløselig in vivo-avbildning og økt tilgjengelighet av skjelettmutanter 2,3. Både finner og skalaer av sebrafisk er i stand til fullstendig regenerering etter fjerning. Skjelettregenerering og skadereparasjon av sebrafiskfinner har blitt studert grundig 4,5, mens sebrafiskskalaer er en nyere beinmodell i felt, men gir fordeler for ex vivo kultur6.
Vektene er svært rikelige, med minst 300 skjell på hver fisk som fungerer som et beskyttende dekke for fisken. Hver skala er en liten mineralisert plate bestående av beindannende osteoblaster og beinresorberende osteoklaster av en kollagenrik skjelettmatrise7. Ossifikasjonsprosessen av både sebrafiskskalaer og menneskelige bein krever differensiering av mesenkymale stamceller til osteoblaster for å danne den mineraliserte matrisen. Sebrafiskskjell gir en stor fordel for skjelettforskning med sin sterke regenerative evne som kan brukes til å studere beinregenerering og reparasjon. Til tross for tilstedeværelsen av både osteoblaster og osteoklaster, mangler sebrafiskskalaer osteocytter som er viktige for human beinremodellering og mekanosensasjon; Den overfladiske plasseringen av vektene betyr at de lett kan fjernes med et par tang. Ved fjerning av skalaen oppstår en kaskade av hendelser, og skalaregenerering begynner 8,9. Det finnes ulike farge- og avbildningsalternativer tilgjengelig for å visualisere aktiviteten til osteoblaster og osteoklaster og mineraliseringen av skalaene, som vist i figur 1. I tillegg betyr tilgjengeligheten av mange relevante fluorescerende transgene reporterlinjer av sebrafisk at man kan visualisere celledynamikk under regenerering 7,10,11. Denne prosessen gjør det mulig å få mer forståelse av de novo beindannelse ved å observere den tidlige mønstret av skalaregenerering på flanken av fisken for å studere morfologi, cellulær aktivitet og genetiske profiler av disse regenererte skalaene. Biologien til skaladannelse og regenerering har blitt godt karakterisert. Det er viktig at vekter kan vise en god prediktiv evne for terapeutisk relevante forbindelser12 og behandling av fisk med glukokortikoider fører til en skala som regenererer for å vise osteoporotiske fenotyper13. Transkriptomet av de regenererende skalaene viser at gener aktivert i skalaregenerering er beriket for de som er knyttet til menneskelige skjelettsykdommer, noe som ytterligere demonstrerer deres relevans som et modellsystem 6,14.
Til slutt kan disse skalaene dyrkes ex vivo i opptil 7 dager. Sammenlignet med cellelinjekulturer som vanligvis består av en enkelt celletype, gir ex vivo skalakultur in vitro benstudiemuligheter i sitt naturlige miljø som inneholder både osteoblaster og osteoklaster med sin naturlige ekstracellulære matrise 8,12,15,16.
Skalakultur lar oss også utføre narkotikascreening for nye osteoanabole mål. Overfloden av skjell på fisken betyr at man kan fylle minst to plater av 96-brønnsplaten fra bare en enkelt fisk, noe som muliggjør sammensatt screening i et flerbrønnsformat der hver enkelt brønn inneholder en skala sammen med sin naturlige nisje av celler. I tillegg, siden skalaene er tynne, er legemiddelabsorpsjonen forutsigbar12. Oppsummert har de elasmoide skalaene til sebrafisk stort potensial i skjelettforskning og kan hjelpe oss med å få mer innsikt i cellehendelsene under beindannelse og reparasjon. Her beskriver vi protokoller for høsting av skjell for å følge regenerering in vivo og kultur av skalaene ex vivo.
De elasmoide skalaene til sebrafisk, som en ny modell for skjelettforskning, har stort potensial for å hjelpe vår forståelse av beinvedlikehold, regenerering og skadereparasjon. Overfloden av skjell på fisk muliggjør screening med middels til høy gjennomstrømning, samtidig som antall dyr som brukes reduseres og intraindividuell variasjon begrenses. Her presenteres protokoller for skalaregenerering og ex vivo skalakultur for å studere regenerering og reparasjon.
Noen kritiske trinn må vurderes når du følger denne protokollen. Forsiktig fjerning av skalaene er viktig, spesielt når du bruker en transgen reporterlinje for å begrense forstyrrelsen i cellepopulasjonen forårsaket av høsting. Hvis man skal sammenligne ontogenetiske skjell, må du sørge for at regionen ikke inneholder spontant regenererende skjell (som naturlig kan oppstå gjennom fiskens levetid). Sørg for at miljøet og utstyret er sterilt for ex vivo kultur for å oppnå optimal celleoverlevelse og minimal infeksjon i kultur.
Avhengig av det spesifikke forskningsspørsmålet kan tilpasninger gjøres til protokollen, for eksempel å kombinere forskjellige transgene reporterlinjer for å visualisere andre celletyper av genuttrykksprofiler under regenerering og reparasjon11,14.
Det brede spekteret av farging man kan utføre på skalaene betyr at for hver testet forbindelse eller tilstand kan man se på dens effekter på beinet fra forskjellige vinkler; mens sp7 / osx-reportere kan vise osteoblasttall, kan ALP-farging visualisere osteoblastaktivitet, TRAP-farging kan visualisere osteoklastaktivitet, Calcein-grønn levende farging kan merke nydannende bein og Alizarin-rød eller von Kossa-farging kan vise skalamineralisering. Luciferaseaktivitet for å kvantifisere osteoblaster kan også brukes12. Kombinert med disse fargeteknikkene kan man lære det relative bidraget fra osteoblaster og osteoklaster til en gitt beineffekt. Vekter mangler osteocytter, som er utbredt i pattedyrbein og er de viktigste driverne for benmekanosensorisk respons; Skalareparasjon og regenerering i denne modellen drives primært av osteoblaster med påfølgende remodellering av osteoklaster 8,9. Det er viktig å merke seg at det er variasjon mellom individer og aldersgrupper20. For å minimere dette må slaktearealet være konstant, da forskjellige lokaliteter kan gi opphav til ulik skjellmorfologi, og det brukes fisk fra samme søskengrupper slik at alder og størrelse er konsistent. Men fordi flere skjell kan slaktes per fisk, kan man kjøre flere eksperimenter med færre fisk, noe som reduserer intraindividuell variasjon.
Oppsummert viser disse protokollene eksperimentelle teknikker som kan brukes på ontogenetiske og regenererende skalaer. Avslutningsvis viser elasmoide skalaer stort potensial som en skjelettmodell for å hjelpe forståelsen av beindannelse og reparasjon; og vil bidra til å redusere dyrebruk for høy gjennomstrømning osteoanabole sammensatte screening.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Mathew Green fra Animal Service Unit for fiskehold og Katy Jepson fra Wolfson Bioimaging Centre. CLH, DB og QT ble finansiert av Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB og QT Intermediate Fellowship 22044), RR ble finansiert av (NHMRC APP1158758). Dette arbeidet ble også støttet av BBSRC-stipendet (BB/T001984/1).
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
Alizarin red | Sigma | A5533 | |
Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
Calcein powder | Sigma | C0875 | |
Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
Cover slips | VWR | 631-0146 | |
Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
Danieau | Sigma | ||
DMEM | Life Technologies | 31053 | |
Falcon tubes | Corning | 430828 | |
Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
Glycerol | Sigma | 81381 | |
Hepes | Sigma | H3375 | |
Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
MQ water | X | ||
N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
Tris | Sigma | 252859 | |
Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L – 28 cm x 11 cm x 17 cm |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L – 28 cm x 7 cm x 11 cm |