Här presenterar vi ett snabbt och kostnadseffektivt arbetsflöde för att karakterisera rabiesvirus (RABV) genom med hjälp av nanoporteknik. Arbetsflödet är avsett att stödja genomikinformerad övervakning på lokal nivå, genom att ge information om cirkulerande RABV-linjer och deras placering inom regionala fylogenier för att vägleda rabieskontrollåtgärder.
Genomdata kan användas för att spåra spridningen och den geografiska spridningen av infektionssjukdomar. Den sekvenseringskapacitet som krävs för genomisk övervakning är dock fortfarande begränsad i många låg- och medelinkomstländer, där hundmedierad rabies och/eller rabies som överförs av vilda djur som vampyrfladdermöss utgör stora folkhälsoproblem och ekonomiska problem. Vi presenterar här ett snabbt och prisvärt arbetsflöde från prov till sekvens till tolkning med hjälp av nanoporteknik. Protokoll för provtagning och diagnos av rabies beskrivs kortfattat, följt av detaljer om det optimerade arbetsflödet för helgenomsekvensering, inklusive primerdesign och optimering för multiplex polymeraskedjereaktion (PCR), en modifierad, billig sekvenseringsbiblioteksförberedelse, sekvensering med live och offline base calling, genetisk härstamningsbeteckning och fylogenetisk analys. Implementering av arbetsflödet demonstreras och kritiska steg lyfts fram för lokal distribution, såsom pipelinevalidering, primeroptimering, inkludering av negativa kontroller och användning av offentligt tillgängliga data och genomiska verktyg (GLUE, MADDOG) för klassificering och placering inom regionala och globala fylogenier. Handläggningstiden för arbetsflödet är 2–3 dagar och kostnaden varierar från 25 USD per prov för en körning med 96 prover till 80 USD per prov för en körning med 12 prov. Vår slutsats är att det är möjligt att inrätta genomisk övervakning av rabiesvirus i låg- och medelinkomstländer och kan stödja framsteg mot det globala målet om noll dödsfall orsakade av rabies hos människor till 2030, samt förbättrad övervakning av spridning av rabies hos vilda djur. Dessutom kan plattformen anpassas för andra patogener, vilket bidrar till att bygga upp en mångsidig genomisk kapacitet som bidrar till epidemi- och pandemiberedskap.
Rabiesvirus (RABV) är ett lyssavirus i familjen Rhabdoviridae som orsakar en dödlig neurologisk sjukdomhos däggdjur. Även om rabies kan förebyggas till 100 % genom vaccination, är det fortfarande ett stort folkhälsoproblem och ekonomiskt problem i endemiska länder. Av de 60 000 dödsfall i rabies som beräknas inträffa varje år är över 95 % i Afrika och Asien där hundar är den primära reservoaren. Däremot har hundvaccinering lett till eliminering av hundmedierad rabies i Västeuropa, Nordamerika och stora delar av Latinamerika. I dessa regioner är reservoarer av rabies nu begränsade till vilda djur, såsom fladdermöss, tvättbjörnar, skunkar och vildahunddjur. Över hela Latinamerika är den vanliga vampyrfladdermusen en problematisk källa till rabies på grund av regelbunden överföring från fladdermöss till både människor och boskap under nattlig blodmatning4. Den årliga globala ekonomiska effekten av rabies uppskattas till 8,6 miljarder dollar, varav boskapsförluster står för 6 %5.
Sekvensdata från virala patogener i kombination med metadata om tidpunkt och källa för infektioner kan ge robusta epidemiologiska insikter6. För RABV har sekvensering använts för att undersöka ursprunget till utbrott7,8, identifiera värdassociationer med vilda djur eller tamhundar 8,9,10,11,12 och spåra källor till fall hos människor 13,14. Utbrottsundersökningar med fylogenetisk analys har visat att rabies uppstod i den tidigare rabiesfria provinsen Bali i Indonesien genom en enda introduktion från de närliggande endemiska områdena Kalimantan eller Sulawesi15. Samtidigt, i Filippinerna, har ett utbrott på ön Tablas i Romblonprovinsen visat sig ha införts från huvudön Luzon16. Virala genomiska data har också använts för att bättre förstå den överföringsdynamik som krävs för att rikta kontrollåtgärder geografiskt. Till exempel illustrerar genomisk karakterisering av RABV den geografiska klustringen av kladerna 17,18,19, samcirkulationen av linjer 20,21,22, humanmedierad viral rörelse 17,23,24 och metapopulationsdynamiken 25,26.
Sjukdomsövervakning är en viktig funktion av genomisk övervakning som har förbättrats i och med den globala ökningen av sekvenseringskapaciteten som svar på SARS-CoV-2-pandemin. Genomisk övervakning har bidragit till spårning i realtid av SARS-COV-2-varianter av särskild betydelse27,28 och tillhörande motåtgärder6. Framsteg inom tillgänglig sekvenseringsteknik, såsom nanoporteknik, har lett till förbättrade och mer prisvärda protokoll för snabb sekvensering av både humana 29,30,31,32 ochdjur 33,34,35 patogener. I många rabiesendemiska länder finns det dock fortfarande hinder för att operationalisera genomisk övervakning av patogener, vilket framgår av globala skillnader i SARS-CoV-2-sekvenseringskapacitet36. Begränsningar i laboratorieinfrastruktur, leveranskedjor och teknisk kunskap gör etablering och rutinisering av genomisk övervakning utmanande. I den här artikeln visar vi hur ett optimerat, snabbt och prisvärt arbetsflöde för helgenomsekvensering kan användas för RABV-övervakning i resursbegränsade miljöer.
Ett tillgängligt RABV, nanopore-baserat, arbetsflöde för helgenomsekvensering utvecklades av Brunker et al.61, med hjälp av resurser från ARTIC-nätverket46. Här presenterar vi ett uppdaterat arbetsflöde med kompletta steg från prov till sekvens till tolkning. Arbetsflödet beskriver beredningen av hjärnvävnadsprover för helgenomsekvensering, presenterar en bioinformatisk pipeline för att bearbeta läsningar och generera konsensussekvenser och belyser två rabiesspecifika verktyg för att automatisera härstamningstilldelning och bestämma fylogenetiskt sammanhang. Det uppdaterade arbetsflödet innehåller också omfattande instruktioner för att konfigurera lämpliga beräknings- och laboratoriearbetsytor, med överväganden för implementering i olika sammanhang (inklusive inställningar med låga resurser). Vi har visat den framgångsrika implementeringen av arbetsflödet i både akademiska och forskningsinstitutsmiljöer i fyra RABV-endemiska låginkomstländer med ingen eller begränsad genomisk övervakningskapacitet. Arbetsflödet har visat sig vara motståndskraftigt mot tillämpning i olika miljöer och begripligt för användare med olika expertis.
Detta arbetsflöde för RABV-sekvensering är det mest omfattande offentligt tillgängliga protokollet (som täcker prov-till-sekvens-till-tolkningssteg) och specifikt anpassat för att minska både start- och driftskostnader. Den tid och kostnad som krävs för biblioteksförberedelse och sekvensering med nanoporteknik minskar kraftigt i förhållande till andra plattformar, såsom Illumina61, och kontinuerlig teknikutveckling förbättrar sekvenskvaliteten och noggrannheten för att vara jämförbar med Illumina62.
Det här protokollet är utformat för att vara motståndskraftigt i olika lågresurskontexter. Genom att hänvisa till vägledningen för felsökning och ändringar som tillhandahålls tillsammans med kärnprotokollet får användarna stöd för att anpassa arbetsflödet efter sina behov. Tillägget av användarvänliga bioinformatiska verktyg till arbetsflödet utgör en stor utveckling av det ursprungliga protokollet, vilket ger snabba och standardiserade metoder som kan tillämpas av användare med minimal tidigare bioinformatisk erfarenhet för att tolka sekvensdata i lokala sammanhang. Kapaciteten att göra detta på plats begränsas ofta av behovet av att ha särskilda programmerings- och fylogenetiska färdigheter, vilket kräver en intensiv och långsiktig investering i kompetensutveckling. Även om denna färdighet är viktig för att grundligt tolka sekvensdata, är grundläggande och tillgängliga tolkningsverktyg lika önskvärda för att kapacitera lokala “sekvenseringsmästare”, vars kärnkompetens kan vara våtlabbbaserad, vilket gör det möjligt för dem att tolka och ta ägarskap över sina data.
Eftersom protokollet har tillämpats under ett antal år i flera länder kan vi nu ge vägledning om hur man optimerar multiplexprimersystem för att förbättra täckningen och hantera ackumulerad mångfald. Ansträngningar har också gjorts för att hjälpa användarna att förbättra kostnadseffektiviteten eller göra det lättare att göra upphandlingen i en viss region, vilket vanligtvis är en utmaning för hållbarheten hos molekylära metoder63. Till exempel, i Afrika (Tanzania, Kenya och Nigeria), valde vi trubbiga/TA-ligasmastermix vid adapterligeringssteget, vilket var mer lättillgängligt från lokala leverantörer och ett billigare alternativ till andra ligeringsreagenser.
Av erfarenhet finns det flera sätt att minska kostnaden per prov och per körning. Att minska antalet prover per körning (t.ex. från 24 ner till 12 prover) kan förlänga livslängden för flödesceller över flera körningar, medan en ökning av antalet prover per körning maximerar tiden och reagenserna. I våra händer kunde vi tvätta och återanvända flödesceller för var tredje sekvenseringskörning, vilket gjorde det möjligt att sekvensera ytterligare 55 prover. Att tvätta flödescellen omedelbart efter användning, eller om det inte är möjligt, ta bort spillvätskan från avfallskanalen efter varje körning, verkade bevara antalet porer som är tillgängliga för en andra körning. Med hänsyn till det initiala antalet porer som finns tillgängliga i en flödescell kan en körning också optimeras för att planera hur många prover som ska köras i en viss flödescell.
Även om arbetsflödet syftar till att vara så omfattande som möjligt, med tillägg av detaljerad vägledning och vägledande resurser, är proceduren fortfarande komplex och kan vara skrämmande för en ny användare. Användaren uppmuntras att söka personlig utbildning och stöd, helst lokalt eller alternativt genom externa samarbetspartners. I Filippinerna har till exempel ett projekt om kapacitetsuppbyggnad inom regionala laboratorier för genomisk övervakning av SARS-CoV-2 med hjälp av ONT utvecklat kärnkompetenser bland diagnostiker inom hälso- och sjukvården som lätt kan överföras till RABV-sekvensering. Viktiga steg, som att rengöra SPRI-pärlor, kan vara svåra att bemästra utan praktisk utbildning, och ineffektiv rengöring kan skada flödescellen och äventyra körningen. Provkontaminering är alltid ett stort problem när amplikoner bearbetas i laboratoriet och kan vara svåra att eliminera. I synnerhet är korskontaminering mellan prover extremt svår att upptäcka under bioinformatik efter körning. God laboratorieteknik och praxis, t.ex. att hålla arbetsytorna rena, separera områden före och efter PCR och införliva negativa kontroller, är absolut nödvändiga för att säkerställa kvalitetskontroll. Den snabba utvecklingen av nanoporsekvensering är både en fördel och en nackdel för rutinmässig RABV-genomisk övervakning. Kontinuerliga förbättringar av nanoporens noggrannhet, tillgänglighet och protokollrepertoar breddar och förbättrar tillämpningsområdet. Samma utveckling gör det dock svårt att upprätthålla standardrutiner och bioinformatiska pipelines. I detta protokoll tillhandahåller vi ett dokument som hjälper till med övergången från äldre till nuvarande förberedelsesatser för nanoporbibliotek (Table of Materials).
Ett vanligt hinder för sekvensering i låg- och medelinkomstländer är tillgänglighet, som inte bara omfattar kostnaden utan även möjligheten att anskaffa förbrukningsvaror i tid (särskilt sekvenseringsreagenser, som är relativt nya för upphandlingsteam och leverantörer) och beräkningsresurser, samt att helt enkelt ha tillgång till stabil kraft och internet. Att använda bärbar nanoporsekvenseringsteknik som grund för detta arbetsflöde hjälper till med många av dessa tillgänglighetsproblem, och vi har demonstrerat användningen av vårt protokoll i en rad olika miljöer, genom att genomföra hela protokollet och analysen i landet. Visserligen är det fortfarande en utmaning att skaffa utrustning och sekvensera förbrukningsvaror i tid, och i många fall var vi tvungna att transportera eller skicka reagenser från Storbritannien. I vissa områden kunde vi dock helt förlita oss på lokala leveransvägar för reagenser och dra nytta av investeringar i SARS-CoV-2-sekvensering (t.ex. Filippinerna) som har effektiviserat upphandlingsprocesserna och börjat normalisera tillämpningen av patogengenomik.
Behovet av en stabil internetanslutning minimeras av engångsinstallationer; till exempel kräver GitHub-lagringsplatser, nedladdning av programvara och nanoporsekvensering i sig bara internetåtkomst för att starta körningen (inte hela tiden) eller kan utföras helt offline med avtal från företaget. Om mobildata är tillgängligt kan en telefon användas som en hotspot till den bärbara datorn för att påbörja sekvenseringskörningen innan den kopplas bort under körningen. Vid rutinmässig bearbetning av prover kan kraven på datalagring växa snabbt, och helst skulle data lagras på en server. Annars är SSD-hårddiskar (Solid State Drive) relativt billiga att köpa.
Även om vi är medvetna om att det fortfarande finns hinder för genomisk övervakning i låginkomstländer, tyder ökade investeringar i att bygga upp genomikens tillgänglighet och expertis (t.ex. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa SGB])64 på att denna situation kommer att förbättras. Genomisk övervakning är avgörande för pandemiberedskap6, och kapacitet kan etableras genom rutinisering av genomisk övervakning av endemiska patogener som RABV. Globala skillnader i sekvenseringskapacitet som belystes under SARS-CoV-2-pandemin bör vara en drivkraft för katalytiska förändringar för att ta itu med dessa strukturella orättvisor.
Detta arbetsflöde från prov-till-sekvens-till-tolkning för RABV, inklusive tillgängliga bioinformatikverktyg, har potential att användas för att vägleda kontrollåtgärder som syftar till att uppnå målet att noll människor ska dö av hundmedierad rabies senast 2030, och i slutändan för att eliminera RABV-varianter. I kombination med relevanta metadata underlättar genomiska data som genereras från detta protokoll snabb karakterisering av RABV under utbrottsundersökningar och vid identifiering av cirkulerande linjer i ett land eller en region60,61,65. Vi illustrerar vår pipeline främst med hjälp av exempel från hundmedierad rabies; Arbetsflödet är dock direkt tillämpligt på rabies hos vilda djur. Denna överförbarhet och låga kostnad minimerar utmaningarna med att göra rutinsekvensering lättillgänglig, inte bara för rabies utan även för andra patogener46,66,67, för att förbättra sjukdomshantering och kontroll.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton-finansiering från Medical Research Council [MR/R025649/1] och Philippines Department of Science and Technology (DOST), UK Research and Innovation Global Effort on COVID-19 [MR/V035444/1], University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], och International Partnership Development Fund, ett DOST British Council-Philippines studentship (CB), ett National Institute for Health Research [17/63/82] GemVi-stipendium (GJ) och University of Glasgow-studenter från MVLS DTP (KC) [125638-06], EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] och Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. Vi är tacksamma för kollegor och samarbetspartners som har stöttat detta arbete: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana och Anna Czupryna.
Brand name | |||
Software | |||
Sequencing software (MinKnow) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/downloads | |
Bioinformatics tool kit (Guppy) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018 | |
Equipment | |||
Thermal cycler (miniPCR™ mini16 thermal cycler) |
Cambio | MP-QP-1016-01 | |
Homogenizer (Precellys Evolution Touch Homogenizer) |
Bertin Instruments | EQ02520-300 | |
Cold Racks (0.2-0.5mL) (PCR Mini-cooler with transparent lid) |
BRAND | 781260 | |
Pipettor | |||
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) | Gilson | SKU: FA10030 | |
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) | Gilson | SKU: FA10024 | |
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) | Gilson | SKU: FA10020 | |
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) | Gilson | SKU: FA10025 | |
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) | Gilson | SKU: FA10021 | |
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) | Gilson | SKU: FA10026 | |
Fluorometer (Qubit 4 Fluorometer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q33238 | |
Laptop (Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU]) |
|||
Microcentrifuge (Refrigerated centrifuge) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 75004081 | |
Vortex mixer (Basic vortex mixer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 88882011 | |
Magnetic rack (DynaMag -2 Magnet) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 12321D | |
Sequencing device (MinION) |
Oxford Nanopore Technologies | MinION Mk1B | |
RNA Extraction | |||
RNA extraction kit (Qiagen RNEasy Mini Kit 250) |
Qiagen | 74106 | |
RNA stabilizing reagents | |||
(RNA later) | Invitrogen | AM7020 | |
(DNA/RNA Shield) | Zymo Research | R1100-50 | |
PCR | |||
Nuclease-free Water (Nuclease-free Water [not DEPC-treated]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | AM9937 | |
Master mix for first strand cDNA synthesis (LunaScript RT SuperMix Kit) |
New England Biolabs | E3010S | |
DNA amplification master mix (Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB]) |
New England Biolabs | M0494L | |
Primer (Scheme) (Custom DNA oligos) |
Invitrogen | ||
SPRI Bead Clean-up | |||
SPRI beads (Aline Biosciences PCR Clean DX ) |
Cambio | AL-AC1003-50 | |
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] | Merck | 818760 | |
Short Fragment buffer (SFB expansion pack) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-SFB001 | |
DNA Quantification | |||
DNA quantification kit (Qubit® dsDNA HS Assay Kit) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32854 | |
DNA quantification assay tubes (Qubit™ Assay Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32856 | |
End Prep and barcoding (Qubit™ Assay Tubes) |
|||
End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module) |
New England Biolabs | E7546L | |
Barcoding kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 | |
(Native Barcoding Expansion 1-12) | EXP-NBD104 | ||
(Native Barcoding Expansion 13-24) | EXP-NBD114 | ||
(Native Barcoding Expansion 96) | EXP-NBD196 | ||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 | |
(not compatible) | (not compatible) | ||
(Native Barcoding Kit 24 V14) | SQK-NBD114.24 | ||
(Native Barcoding Kit 96 V14) | SQK-NBD114.96 | ||
Ligation mastermix (Blunt/TA Ligase Master Mix) |
New England Biolabs | M0367S | |
Adapter Ligation | |||
Adapter ligation master mix | |||
(NEBNext Quick Ligation Module) | New England Biolabs | E6056S | |
(NEBNext Ultra II Ligation Module) | New England Biolabs | E7595S | |
(Blunt/TA Ligase Master Mix) | New England Biolabs | M0367S | |
Adapter mix | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-AMII001 |
|
(Adapter Mix II [AMII]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-NBA114 |
|
(Native adapter [NA]) | |||
Sequencing | |||
Flowcell priming kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-FLP002 |
|
(Flush Buffer [FB]) | |||
(Flush Tether [FT]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-FLP004 |
|
(Flow Cell Flush [FCF]) | |||
(Flow Cell Tether [FCT]) | |||
Ligation Sequencing Kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 SQK-LSK109 |
|
Adapter Mix (Adapter Mix [AMX]) |
|||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SQB]) |
|||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
Loading Beads (Loading Beads [LB]) |
|||
Sequencing Tether (Sequencing Tether [SQT]) |
|||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 SQK-LSK114 |
|
Adapter Mix (Ligation Adapter [LA]) |
|||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SB]) |
|||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
Loading Beads (Loading Beads [LIB]) |
|||
Sequencing Tether (Flow Cell Tether [FCT]) |
|||
Library solution (Library solution [LIS]) |
|||
Flush buffer (Flow Cell Flush [FCF]) |
|||
Flow Cell | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 FLO-MIN106D |
|
(Flow Cell [R9.4.1]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 FLO-MIN114 |
|
(Flow Cell [R10.4.1]) | |||
Flow Cell wash | |||
Flowcell wash kit (Flow cell wash kit) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 | |
Consummables | |||
Surface decontaminant | |||
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7010PK | |
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7002PK | |
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap (PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner]) |
Greiner | 608281 | |
PCR Tube 0.2ml (PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner]) |
Greiner | 671201 | |
1000µL Filter Tips (500) (Stacked 1000µL Filter Tips [500]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11977724 | |
100µL Filter Tips (1000) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11947724 | |
10µL Filter Tips (1000) (Stacked 100µL Filter Tips [1000]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11907724 | |
Reinforced tubes tubes (2ml) with screw caps and o-rings (Fisherbrand™ Bulk tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 15545809 | |
Microcentrifuge tube (1.5ml) (1.5 ml Eppendorf Tubes [500]) |
Eppendorf | 1229888 | |
DNA LoBind Tubes (1.5ml) (DNA LoBind Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 10051232 | |
Cryobabies labels | |||
Gloves (S/M/L) | |||
Paper towel |