यहां, हम नैनोपोर तकनीक का उपयोग करके रेबीज वायरस (आरएबीवी) जीनोम को चिह्नित करने के लिए एक तेज़ और लागत प्रभावी वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं। वर्कफ़्लो का उद्देश्य स्थानीय स्तर पर जीनोमिक्स-सूचित निगरानी का समर्थन करना है, जो रेबीज नियंत्रण उपायों का मार्गदर्शन करने के लिए आरएबीवी वंशावली और क्षेत्रीय फ़ाइलोजिनिस के भीतर उनके प्लेसमेंट के बारे में जानकारी प्रदान करता है।
जीनोमिक डेटा का उपयोग संक्रामक रोगों के संचरण और भौगोलिक प्रसार को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, जीनोमिक निगरानी के लिए आवश्यक अनुक्रमण क्षमता कई निम्न और मध्यम आय वाले देशों (LMICs) में सीमित है, जहां कुत्ते-मध्यस्थता रेबीज और / या पिशाच चमगादड़ जैसे वन्यजीवों द्वारा प्रेषित रेबीज प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य और आर्थिक चिंताएं पैदा करते हैं। हम यहां नैनोपोर तकनीक का उपयोग करके एक तेज़ और सस्ती नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं। नमूना संग्रह और रेबीज के निदान के लिए प्रोटोकॉल संक्षेप में वर्णित हैं, इसके बाद अनुकूलित संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण वर्कफ़्लो का विवरण दिया गया है, जिसमें मल्टीप्लेक्स पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए प्राइमर डिज़ाइन और अनुकूलन, एक संशोधित, कम लागत वाली अनुक्रमण लाइब्रेरी तैयारी, लाइव और ऑफलाइन बेस कॉलिंग के साथ अनुक्रमण, आनुवंशिक वंश पदनाम और फाइटोलैनेटिक विश्लेषण शामिल हैं। वर्कफ़्लो के कार्यान्वयन का प्रदर्शन किया जाता है, और स्थानीय तैनाती के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डाला जाता है, जैसे कि पाइपलाइन सत्यापन, प्राइमर अनुकूलन, नकारात्मक नियंत्रणों को शामिल करना, और क्षेत्रीय और वैश्विक फ़ाइलोजिनिस के भीतर वर्गीकरण और प्लेसमेंट के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटा और जीनोमिक टूल (गोंद, मैडडॉग) का उपयोग। वर्कफ़्लो के लिए टर्नअराउंड समय 2-3 दिन है, और लागत 96 नमूना रन के लिए $ 25 प्रति नमूना से लेकर 12 नमूना रन के लिए $ 80 प्रति नमूना तक होती है। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि एलएमआईसी में रेबीज वायरस जीनोमिक निगरानी स्थापित करना संभव है और 2030 तक शून्य कुत्ते-मध्यस्थता वाले मानव रेबीज मौतों के वैश्विक लक्ष्य की दिशा में प्रगति का समर्थन कर सकता है, साथ ही वन्यजीव रेबीज प्रसार की बढ़ी हुई निगरानी भी कर सकता है। इसके अलावा, मंच को अन्य रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे एक बहुमुखी जीनोमिक क्षमता बनाने में मदद मिलती है जो महामारी और महामारी की तैयारी में योगदान देती है।
रेबीज वायरस (आरएबीवी) रैब्डोविरिडे परिवार में एक लाइसावायरस है जो स्तनधारियों में एक घातक न्यूरोलॉजिकल बीमारी का कारण बनताहै। यद्यपि रेबीज टीकाकरण द्वारा 100% रोकथाम योग्य है, यह स्थानिक देशों में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य और आर्थिक चिंता का विषय बना हुआ है। हर साल होने वाली 60,000 मानव रेबीज मौतों में से, 95% से अधिक अफ्रीका और एशिया में हैं जहां कुत्ते प्राथमिक जलाशयहैं। इसके विपरीत, कुत्ते के टीकाकरण ने पश्चिमी यूरोप, उत्तरी अमेरिका और लैटिन अमेरिका के अधिकांश हिस्सों में कुत्ते-मध्यस्थता रेबीज के उन्मूलन को जन्म दिया है। इन क्षेत्रों में, रेबीज के जलाशय अब वन्यजीवों तक ही सीमित हैं, जैसे चमगादड़, रैकून, स्कंक और जंगली कैनिड्स3। लैटिन अमेरिका में, आम पिशाच चमगादड़ रेबीज का एक समस्याग्रस्त स्रोत है क्योंकि रात मेंरक्त पिलाने के दौरान चमगादड़ से मनुष्यों और पशुधन दोनों में नियमित रूप से स्पिलओवर संचरण होता है। रेबीज का वार्षिक वैश्विक आर्थिक प्रभाव $ 8.6 बिलियन होने का अनुमान है, जिसमें पशुधन का नुकसान 6% 5% है।
संक्रमण के समय और स्रोत पर मेटाडेटा के साथ संयुक्त वायरल रोगजनकों से अनुक्रम डेटा मजबूत महामारी विज्ञान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकताहै। आरएबीवी के लिए, अनुक्रमण का उपयोग प्रकोप 7,8 की उत्पत्ति की जांच करने, वन्यजीवों या घरेलू कुत्तों के साथ मेजबान संघों की पहचान करने और मानव मामलों के स्रोतों का पता लगानेके लिए किया गयाहै। फाइटोलैनेटिक विश्लेषण का उपयोग करके प्रकोप की जांच ने संकेत दिया है कि रेबीज पूर्व में रेबीज-मुक्त प्रांत बाली, इंडोनेशिया में उभरा, कालीमंतन या सुलावेसी15 के पास के स्थानिक क्षेत्रों से एक परिचय के माध्यम से। इस बीच, फिलीपींस में, तबलास द्वीप, रोम्बलॉन प्रांत पर एक प्रकोप लुज़ोन16 के मुख्य द्वीप से पेश किया गया था। भौगोलिक रूप से नियंत्रण उपायों को लक्षित करने के लिए आवश्यक रोगज़नक़ संचरण गतिशीलता को बेहतर ढंग से समझने के लिए वायरल जीनोमिक डेटा का भी उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, आरएबीवी का जीनोमिक लक्षण वर्णन क्लेड 17,18,19 के भौगोलिक क्लस्टरिंग, वंशावली20,21,22 के सह-परिसंचरण, मानव-मध्यस्थता वायरल आंदोलन 17,23,24 और मेटापॉपुलेशन डायनामिक्स 25,26 को दर्शाता है।
रोग निगरानी जीनोमिक निगरानी का एक महत्वपूर्ण कार्य है जिसे सार्स-सीओवी-2 महामारी के जवाब में अनुक्रमण क्षमता में वैश्विक वृद्धि के साथ बढ़ाया गया है। जीनोमिक निगरानी ने सार्स-सीओवी-2 वेरिएंट ्स की रियल-टाइम ट्रैकिंग का समर्थन किया है। नैनोपोर तकनीक जैसी सुलभ अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में प्रगति ने मानव 29,30,31,32 और पशु33,34,35 रोगजनकों दोनों के तेजी से अनुक्रमण के लिए बेहतर और अधिक किफायती प्रोटोकॉल का नेतृत्व किया है। हालांकि, कई रेबीज स्थानिक देशों में, रोगज़नक़ जीनोमिक निगरानी को संचालित करने में अभी भी बाधाएं हैं, जैसा कि सार्स-सीओवी-2 अनुक्रमण क्षमता36 में वैश्विक असमानताओं से पता चलता है। प्रयोगशाला के बुनियादी ढांचे, आपूर्ति श्रृंखला और तकनीकी ज्ञान में सीमाएं जीनोमिक निगरानी की स्थापना और पुनरावृत्ति को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। इस पेपर में, हम प्रदर्शित करते हैं कि संसाधन-सीमित सेटिंग्स में आरएबीवी निगरानी के लिए एक अनुकूलित, तेज और सस्ती संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण वर्कफ़्लो कैसे तैनात किया जा सकता है।
एक सुलभ आरएबीवी, नैनोपोर-आधारित, संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण वर्कफ़्लो को ब्रुंकर एट अल.61 द्वारा विकसित किया गया था, जिसमें आर्टिक नेटवर्क46 के संसाधनों का उपयोग किया गया था। यहां, हम पूर्ण नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या चरणों के साथ एक अद्यतन वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं। वर्कफ़्लो पूरे जीनोम अनुक्रमण के लिए मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों की तैयारी का विवरण देता है, आम सहमति अनुक्रमों को संसाधित करने और उत्पन्न करने के लिए एक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन प्रस्तुत करता है, और वंश असाइनमेंट को स्वचालित करने और फाइटोलैनेटिक संदर्भ निर्धारित करने के लिए दो रेबीज-विशिष्ट उपकरणों पर प्रकाश डालता है। अद्यतन वर्कफ़्लो विभिन्न संदर्भों (कम-संसाधन सेटिंग्स सहित) में कार्यान्वयन के लिए विचारों के साथ उपयुक्त कम्प्यूटेशनल और प्रयोगशाला कार्यस्थानों के सेटअप के लिए व्यापक निर्देश भी प्रदान करता है। हमने बिना या सीमित जीनोमिक निगरानी क्षमता के साथ चार आरएबीवी स्थानिक एलएमआईसी में अकादमिक और अनुसंधान संस्थान सेटिंग्स दोनों में वर्कफ़्लो के सफल कार्यान्वयन का प्रदर्शन किया है। वर्कफ़्लो विभिन्न सेटिंग्स में अनुप्रयोग के लिए लचीला साबित हुआ है, और अलग-अलग विशेषज्ञता वाले उपयोगकर्ताओं द्वारा समझने योग्य है।
RABV अनुक्रमण के लिए यह वर्कफ़्लो सबसे व्यापक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल है (नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या चरणों को कवर करता है) और विशेष रूप से स्टार्टअप और रनिंग लागत दोनों को कम करने के लिए अनुकूलित है। नैनोपोर तकनीक के साथ पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए आवश्यक समय और लागत अन्य प्लेटफार्मों के सापेक्ष बहुत कम हो जाती है, जैसे कि इलुमिना61, और निरंतर प्रौद्योगिकी विकास अनुक्रम गुणवत्ता और सटीकता में सुधार कर रहे हैं जो इलुमिना62 के साथ तुलनीय है।
यह प्रोटोकॉल विविध कम-संसाधन संदर्भों में लचीला होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कोर प्रोटोकॉल के साथ प्रदान किए गए समस्या निवारण और संशोधन मार्गदर्शन का उल्लेख करके, उपयोगकर्ताओं को वर्कफ़्लो को उनकी आवश्यकताओं के अनुकूल बनाने के लिए समर्थित किया जाता है। वर्कफ़्लो में उपयोगकर्ता के अनुकूल जैव सूचना विज्ञान उपकरणों को जोड़ना मूल प्रोटोकॉल के लिए एक प्रमुख विकास का गठन करता है, जो तेजी से और मानकीकृत तरीके प्रदान करता है जिन्हें स्थानीय संदर्भों में अनुक्रम डेटा की व्याख्या करने के लिए न्यूनतम पूर्व जैव सूचना विज्ञान अनुभव वाले उपयोगकर्ताओं द्वारा लागू किया जा सकता है। सीटू में ऐसा करने की क्षमता अक्सर विशिष्ट प्रोग्रामिंग और फाइटोलैनेटिक कौशल की आवश्यकता से सीमित होती है, जिसके लिए गहन और दीर्घकालिक कौशल प्रशिक्षण निवेश की आवश्यकता होती है। जबकि यह कौशल अनुक्रम डेटा की पूरी तरह से व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है, स्थानीय “अनुक्रमण चैंपियन” को कैपेसिट करने के लिए बुनियादी और सुलभ व्याख्या उपकरण समान रूप से वांछनीय हैं, जिनकी मुख्य विशेषज्ञता गीली प्रयोगशाला आधारित हो सकती है, जिससे उन्हें अपने डेटा की व्याख्या करने और स्वामित्व लेने में सक्षम बनाया जा सके।
जैसा कि प्रोटोकॉल कई देशों में कई वर्षों से किया गया है, अब हम कवरेज में सुधार और संचित विविधता से निपटने के लिए मल्टीप्लेक्स प्राइमर योजनाओं को अनुकूलित करने के तरीके पर मार्गदर्शन प्रदान कर सकते हैं। उपयोगकर्ताओं को लागत-प्रभावशीलता में सुधार करने या किसी दिए गए क्षेत्र में खरीद में आसानी की अनुमति देने में मदद करने के प्रयास भी किए गए हैं, जो आमतौर पर आणविक दृष्टिकोणकी स्थिरता के लिए एक चुनौती है। उदाहरण के लिए, अफ्रीका (तंजानिया, केन्या और नाइजीरिया) में, हमने एडेप्टर लिगेशन चरण में ब्लंट / टीए लिगेज मास्टर मिश्रण का विकल्प चुना, जो स्थानीय आपूर्तिकर्ताओं से अधिक आसानी से उपलब्ध था और अन्य लिगेशन अभिकर्मकों के लिए एक सस्ता विकल्प था।
अनुभव से, प्रति नमूना और प्रति रन लागत को कम करने के कई तरीके हैं। प्रति रन नमूनों की संख्या को कम करना (उदाहरण के लिए, 24 से 12 नमूने तक) प्रवाह कोशिकाओं के जीवन को कई रन पर बढ़ा सकता है, जबकि प्रति रन नमूनों की संख्या बढ़ाने से समय और अभिकर्मकों को अधिकतम किया जा सकता है। हमारे हाथों में, हम हर तीन अनुक्रमण रन में से एक के लिए प्रवाह कोशिकाओं को धोने और पुन: उपयोग करने में सक्षम थे, जिससे अतिरिक्त 55 नमूनों को अनुक्रमित किया जा सके। उपयोग के तुरंत बाद प्रवाह सेल को धोना, या यदि संभव नहीं है, तो हर रन के बाद अपशिष्ट चैनल से अपशिष्ट तरल पदार्थ को हटाना, दूसरे रन के लिए उपलब्ध छिद्रों की संख्या को संरक्षित करना प्रतीत होता है। एक प्रवाह सेल में उपलब्ध छिद्रों की प्रारंभिक संख्या को ध्यान में रखते हुए, एक रन को यह योजना बनाने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है कि किसी विशेष प्रवाह सेल में कितने नमूने चलाने हैं।
यद्यपि वर्कफ़्लो का उद्देश्य विस्तृत मार्गदर्शन और साइनपोस्ट किए गए संसाधनों को जोड़ने के साथ यथासंभव व्यापक होना है, प्रक्रिया अभी भी जटिल है और एक नए उपयोगकर्ता के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है। उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत रूप से प्रशिक्षण और समर्थन प्राप्त करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, आदर्श रूप से स्थानीय रूप से, या वैकल्पिक रूप से बाहरी सहयोगियों के माध्यम से। उदाहरण के लिए, फिलीपींस में, ओएनटी का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 जीनोमिक निगरानी के लिए क्षेत्रीय प्रयोगशालाओं के भीतर क्षमता निर्माण पर एक परियोजना ने स्वास्थ्य देखभाल निदानकर्ताओं के बीच मुख्य दक्षताओं को विकसित किया है जो आरएबीवी अनुक्रमण के लिए आसानी से हस्तांतरणीय हैं। एसपीआरआई बीड क्लीन अप जैसे महत्वपूर्ण कदम, हाथों पर प्रशिक्षण के बिना मास्टर करना मुश्किल हो सकता है, और अप्रभावी सफाई प्रवाह सेल को नुकसान पहुंचा सकती है और रन से समझौता कर सकती है। नमूना संदूषण हमेशा एक प्रमुख चिंता का विषय होता है जब प्रयोगशाला में एम्प्लिकॉन संसाधित किए जा रहे होते हैं और इसे खत्म करना मुश्किल हो सकता है। विशेष रूप से, पोस्ट-रन जैव सूचना विज्ञान के दौरान नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण का पता लगाना बेहद मुश्किल है। अच्छी प्रयोगशाला तकनीक और प्रथाएं, जैसे कि साफ काम की सतहों को बनाए रखना, पूर्व और बाद के पीसीआर क्षेत्रों को अलग करना, और नकारात्मक नियंत्रण को शामिल करना, गुणवत्ता नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए अनिवार्य हैं। नैनोपोर अनुक्रमण विकास की तेज गति नियमित आरएबीवी जीनोमिक निगरानी के लिए एक लाभ और नुकसान दोनों है। नैनोपोर की सटीकता, पहुंच और प्रोटोकॉल प्रदर्शनों की सूची में निरंतर सुधार इसके आवेदन के दायरे को चौड़ा और बेहतर बनाता है। हालांकि, वही विकास मानक संचालन प्रक्रियाओं और जैव सूचना त्मक पाइपलाइनों को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम पुराने से वर्तमान नैनोपोर लाइब्रेरी तैयारी किट (सामग्री की तालिका) में संक्रमण की सहायता करने वाला एक दस्तावेज प्रदान करते हैं।
एलएमआईसी में अनुक्रमण के लिए एक आम बाधा पहुंच है, जिसमें न केवल लागत शामिल है, बल्कि समय पर तरीके से उपभोग्य सामग्रियों की खरीद करने की क्षमता भी शामिल है (विशेष रूप से अनुक्रमण अभिकर्मकों, जो खरीद टीमों और आपूर्तिकर्ताओं के लिए अपेक्षाकृत नए हैं) और कम्प्यूटेशनल संसाधन, साथ ही साथ स्थिर शक्ति और इंटरनेट तक पहुंच होना। इस वर्कफ़्लो की नींव के रूप में पोर्टेबल नैनोपोर अनुक्रमण तकनीक का उपयोग करने से इनमें से कई पहुंच समस्याओं में मदद मिलती है, और हमने देश में पूर्ण प्रोटोकॉल और विश्लेषण का संचालन करते हुए सेटिंग्स की एक श्रृंखला में हमारे प्रोटोकॉल के उपयोग का प्रदर्शन किया है। बेशक, समय पर उपकरण और अनुक्रमण उपभोग्य सामग्रियों की खरीद एक चुनौती बनी हुई है और, कई उदाहरणों में, हमें यूके से अभिकर्मकों को ले जाने या जहाज करने के लिए मजबूर किया गया था। हालांकि, कुछ क्षेत्रों में, हम अभिकर्मकों के लिए पूरी तरह से स्थानीय आपूर्ति मार्गों पर भरोसा करने में सक्षम थे, सार्स-सीओवी-2 अनुक्रमण (जैसे, फिलीपींस) में निवेश से लाभान्वित हुए, जिसने खरीद प्रक्रियाओं को सुव्यवस्थित किया है और रोगज़नक़ जीनोमिक्स के आवेदन को सामान्य करना शुरू कर दिया है।
एक स्थिर इंटरनेट कनेक्शन की आवश्यकता को एक-बार-केवल इंस्टॉल द्वारा कम किया जाता है; उदाहरण के लिए, गिटहब रिपॉजिटरी, सॉफ्टवेयर डाउनलोड और नैनोपोर अनुक्रमण को केवल रन शुरू करने के लिए इंटरनेट एक्सेस की आवश्यकता होती है (पूरे नहीं) या कंपनी से समझौते के साथ पूरी तरह से ऑफ़लाइन प्रदर्शन किया जा सकता है। यदि मोबाइल डेटा उपलब्ध है, तो रन अवधि के लिए डिस्कनेक्ट करने से पहले, अनुक्रमण रन शुरू करने के लिए लैपटॉप के हॉटस्पॉट के रूप में एक फोन का उपयोग किया जा सकता है। नियमित रूप से नमूने संसाधित करते समय, डेटा भंडारण आवश्यकताएं तेजी से बढ़ सकती हैं, और आदर्श रूप से डेटा को सर्वर पर संग्रहीत किया जाएगा। अन्यथा, सॉलिड स्टेट ड्राइव (एसएसडी) हार्ड ड्राइव स्रोत के लिए अपेक्षाकृत सस्ते हैं।
जबकि हम मानते हैं कि एलएमआईसी में जीनोमिक निगरानी के लिए अभी भी बाधाएं हैं, जीनोमिक्स पहुंच और विशेषज्ञता (जैसे, अफ्रीका पैथोजन जीनोमिक्स इनिशिएटिव [अफ्रीका पीजीआई]) के निर्माण में बढ़ते निवेश से पता चलता है कि इस स्थिति में सुधार होगा। महामारीकी तैयारी के लिए जीनोमिक निगरानी महत्वपूर्ण है, और आरएबीवी जैसे स्थानिक रोगजनकों की जीनोमिक निगरानी के माध्यम से क्षमता स्थापित की जा सकती है। सार्स-सीओवी-2 महामारी के दौरान उजागर की गई अनुक्रमण क्षमताओं में वैश्विक असमानताओं को इन संरचनात्मक असमानताओं को दूर करने के लिए उत्प्रेरक परिवर्तन का एक चालक होना चाहिए।
आरएबीवी के लिए यह नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या वर्कफ़्लो, जिसमें सुलभ जैव सूचना विज्ञान उपकरण शामिल हैं, का उपयोग 2030 तक कुत्ते-मध्यस्थता रेबीज से शून्य मानव मौतों के लक्ष्य को लक्षित करने वाले नियंत्रण उपायों को निर्देशित करने और अंततः आरएबीवी वेरिएंट के उन्मूलन के लिए किया जा सकता है। प्रासंगिक मेटाडेटा के साथ संयुक्त, इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न जीनोमिक डेटा प्रकोप की जांच के दौरान और किसी देश या क्षेत्रमें परिसंचारी वंशावली की पहचान में तेजी से आरएबीवी लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करता है। हम अपनी पाइपलाइन को ज्यादातर कुत्ते-मध्यस्थता रेबीज के उदाहरणों का उपयोग करके चित्रित करते हैं; हालांकि, वर्कफ़्लो सीधे वन्यजीव रेबीज पर लागू होता है। यह हस्तांतरणीयता और कम लागत नियमित अनुक्रमण को आसानी से उपलब्ध कराने में चुनौतियों को कम करती है, न केवल रेबीज के लिए बल्कि अन्य रोगजनकों के लिए भीरोग प्रबंधन और नियंत्रण में सुधार के लिए।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को वेलकम [207569/जेड/17/जेड, 224670/जेड/21/जेड], मेडिकल रिसर्च काउंसिल [एमआर/R025649/1] और फिलीपींस डिपार्टमेंट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (डीओएसटी), यूके रिसर्च एंड इनोवेशन ग्लोबल इफरमेंट ऑन कोविड-19 [एमआर/V035444/1], यूनिवर्सिटी ऑफ ग्लासगो इंस्टीट्यूशनल स्ट्रेटेजिक सपोर्ट फंड [204820], मेडिकल रिसर्च काउंसिल न्यू इन्वेस्टिगेटर अवार्ड (केबी) [एमआर/X002047] से फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। और इंटरनेशनल पार्टनरशिप डेवलपमेंट फंड, एक डीओएसटी ब्रिटिश काउंसिल-फिलीपींस स्टूडेंट्सशिप (सीबी), एक नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च [17/63/82] जेमवी छात्रवृत्ति (जीजे), और ग्लासगो विश्वविद्यालय के छात्र एमवीएलएस डीटीपी (केसी) [125638-06], ईपीएसआरसी डीटीपी (आरडी) [ईपी / 218518 T517896 / हम उन सहयोगियों और सहयोगियों के आभारी हैं जिन्होंने इस काम का समर्थन किया है: डैनियल स्ट्रेकर, एलिस ब्रोस, एलिजाबेथ मिरांडा, डीवीएम, डारिया मनालो, डीवीएम, थुम्बी मवांगी, कैनेडी लुशासी, चार्ल्स कायुकी, जूड कार्लो बोलिवर, जेरोमिर बॉन्डोक, एस्टेवन बाल्बिन, रोनेल टोंगोहान, अगाथा उकांडे, डेविस कुचाका, मुम्बुआ मुतुंगा, लुटिको सिकाना, और अन्ना क्ज़ुप्रिना।
Brand name | |||
Software | |||
Sequencing software (MinKnow) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/downloads | |
Bioinformatics tool kit (Guppy) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018 | |
Equipment | |||
Thermal cycler (miniPCR™ mini16 thermal cycler) |
Cambio | MP-QP-1016-01 | |
Homogenizer (Precellys Evolution Touch Homogenizer) |
Bertin Instruments | EQ02520-300 | |
Cold Racks (0.2-0.5mL) (PCR Mini-cooler with transparent lid) |
BRAND | 781260 | |
Pipettor | |||
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) | Gilson | SKU: FA10030 | |
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) | Gilson | SKU: FA10024 | |
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) | Gilson | SKU: FA10020 | |
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) | Gilson | SKU: FA10025 | |
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) | Gilson | SKU: FA10021 | |
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) | Gilson | SKU: FA10026 | |
Fluorometer (Qubit 4 Fluorometer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q33238 | |
Laptop (Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU]) |
|||
Microcentrifuge (Refrigerated centrifuge) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 75004081 | |
Vortex mixer (Basic vortex mixer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 88882011 | |
Magnetic rack (DynaMag -2 Magnet) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 12321D | |
Sequencing device (MinION) |
Oxford Nanopore Technologies | MinION Mk1B | |
RNA Extraction | |||
RNA extraction kit (Qiagen RNEasy Mini Kit 250) |
Qiagen | 74106 | |
RNA stabilizing reagents | |||
(RNA later) | Invitrogen | AM7020 | |
(DNA/RNA Shield) | Zymo Research | R1100-50 | |
PCR | |||
Nuclease-free Water (Nuclease-free Water [not DEPC-treated]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | AM9937 | |
Master mix for first strand cDNA synthesis (LunaScript RT SuperMix Kit) |
New England Biolabs | E3010S | |
DNA amplification master mix (Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB]) |
New England Biolabs | M0494L | |
Primer (Scheme) (Custom DNA oligos) |
Invitrogen | ||
SPRI Bead Clean-up | |||
SPRI beads (Aline Biosciences PCR Clean DX ) |
Cambio | AL-AC1003-50 | |
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] | Merck | 818760 | |
Short Fragment buffer (SFB expansion pack) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-SFB001 | |
DNA Quantification | |||
DNA quantification kit (Qubit® dsDNA HS Assay Kit) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32854 | |
DNA quantification assay tubes (Qubit™ Assay Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32856 | |
End Prep and barcoding (Qubit™ Assay Tubes) |
|||
End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module) |
New England Biolabs | E7546L | |
Barcoding kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 | |
(Native Barcoding Expansion 1-12) | EXP-NBD104 | ||
(Native Barcoding Expansion 13-24) | EXP-NBD114 | ||
(Native Barcoding Expansion 96) | EXP-NBD196 | ||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 | |
(not compatible) | (not compatible) | ||
(Native Barcoding Kit 24 V14) | SQK-NBD114.24 | ||
(Native Barcoding Kit 96 V14) | SQK-NBD114.96 | ||
Ligation mastermix (Blunt/TA Ligase Master Mix) |
New England Biolabs | M0367S | |
Adapter Ligation | |||
Adapter ligation master mix | |||
(NEBNext Quick Ligation Module) | New England Biolabs | E6056S | |
(NEBNext Ultra II Ligation Module) | New England Biolabs | E7595S | |
(Blunt/TA Ligase Master Mix) | New England Biolabs | M0367S | |
Adapter mix | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-AMII001 |
|
(Adapter Mix II [AMII]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-NBA114 |
|
(Native adapter [NA]) | |||
Sequencing | |||
Flowcell priming kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-FLP002 |
|
(Flush Buffer [FB]) | |||
(Flush Tether [FT]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-FLP004 |
|
(Flow Cell Flush [FCF]) | |||
(Flow Cell Tether [FCT]) | |||
Ligation Sequencing Kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 SQK-LSK109 |
|
Adapter Mix (Adapter Mix [AMX]) |
|||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SQB]) |
|||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
Loading Beads (Loading Beads [LB]) |
|||
Sequencing Tether (Sequencing Tether [SQT]) |
|||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 SQK-LSK114 |
|
Adapter Mix (Ligation Adapter [LA]) |
|||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SB]) |
|||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
Loading Beads (Loading Beads [LIB]) |
|||
Sequencing Tether (Flow Cell Tether [FCT]) |
|||
Library solution (Library solution [LIS]) |
|||
Flush buffer (Flow Cell Flush [FCF]) |
|||
Flow Cell | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 FLO-MIN106D |
|
(Flow Cell [R9.4.1]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 FLO-MIN114 |
|
(Flow Cell [R10.4.1]) | |||
Flow Cell wash | |||
Flowcell wash kit (Flow cell wash kit) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 | |
Consummables | |||
Surface decontaminant | |||
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7010PK | |
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7002PK | |
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap (PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner]) |
Greiner | 608281 | |
PCR Tube 0.2ml (PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner]) |
Greiner | 671201 | |
1000µL Filter Tips (500) (Stacked 1000µL Filter Tips [500]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11977724 | |
100µL Filter Tips (1000) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11947724 | |
10µL Filter Tips (1000) (Stacked 100µL Filter Tips [1000]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11907724 | |
Reinforced tubes tubes (2ml) with screw caps and o-rings (Fisherbrand™ Bulk tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 15545809 | |
Microcentrifuge tube (1.5ml) (1.5 ml Eppendorf Tubes [500]) |
Eppendorf | 1229888 | |
DNA LoBind Tubes (1.5ml) (DNA LoBind Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 10051232 | |
Cryobabies labels | |||
Gloves (S/M/L) | |||
Paper towel |