Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale
Summary
Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l’encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l’epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) 35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.
Abstract
L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) indotta dalla glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) richiede l’immunizzazione con un peptide MOG emulsionato in adiuvante completo di Freund (CFA) contenente Mycobacterium tuberculosis inattivato. I componenti antigenici del micobatterio attivano le cellule dendritiche per stimolare le cellule T a produrre citochine che promuovono la risposta Th1 attraverso i recettori toll-like. Pertanto, la quantità e la specie di micobatteri presenti durante la sfida antigenica sono direttamente correlate allo sviluppo di EAE. Questo documento sui metodi presenta un protocollo alternativo per indurre EAE in topi C57BL / 6 utilizzando un adiuvante di Freund incompleto modificato contenente il ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis ucciso dal calore.
M. paratuberculosis, un membro del complesso Mycobacterium avium, è l’agente eziologico della malattia di Johne nei ruminanti ed è stato identificato come un fattore di rischio per diverse malattie umane mediate da cellule T, tra cui la sclerosi multipla. Nel complesso, i topi immunizzati con Mycobacterium paratuberculosis hanno mostrato un esordio precoce e una maggiore gravità della malattia rispetto ai topi immunizzati con CFA contenenti il ceppo di M. tuberculosis H37Ra alle stesse dosi di 4 mg/ml. I determinanti antigenici del ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) sono stati in grado di indurre una forte risposta cellulare Th1 durante la fase effettrice, caratterizzata da un numero significativamente più elevato di linfociti T (CD4+ CD27+), cellule dendritiche (CD11c+ I-A/I-E+) e monociti (CD11b+ CD115+) nella milza rispetto ai topi immunizzati con CFA. Inoltre, la risposta proliferativa delle cellule T al peptide MOG sembrava essere più alta nei topi immunizzati con M. paratubercolosi. L’uso di un encefalogeno (ad esempio, MOG35-55) emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis nella formulazione può essere un metodo alternativo e convalidato per attivare le cellule dendritiche per l’innesco delle cellule T CD4+ specifiche dell’epitopo mielinico durante la fase di induzione dell’EAE.
Introduction
L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello comune per lo studio dei disturbi demielinizzanti umani1. Esistono diversi modelli di EAE: immunizzazione attiva utilizzando diversi peptidi di mielina in combinazione con potenti adiuvanti, immunizzazione passiva mediante trasferimento in vitro di linfociti CD4+ specifici della mielina e modelli transgenici diEAE 2 spontanei. Ognuno di questi modelli ha caratteristiche specifiche che consentono di studiare diversi aspetti dell’EAE, come l’insorgenza, la fase effettrice o la fase cronica. Il modello di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) di EAE è un buon modello per studiare i meccanismi immuno-mediati della neuroinfiammazione cronica e della demielinizzazione, poiché è caratterizzato da infiltrazione infiammatoria mononucleare, demielinizzazione nella sostanza bianca periferica e ridotto recupero dopoil picco 1 della malattia.
MOG-EAE è indotta dall’immunizzazione di topi sensibili con il peptide MOG35-55 in adiuvante completo di Freund (CFA), seguito da un’iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse. Ciò aumenta la permeabilità della barriera emato-encefalica e consente alle cellule T mielina-specifiche attivate nella periferia di raggiungere il sistema nervoso centrale (SNC), dove saranno riattivate3. Il CFA svolge un ruolo chiave nell’induzione dell’EAE migliorando l’assorbimento dell’antigene da parte delle cellule presentanti l’antigene e l’espressione di citochine correlate alle risposte umorali e cellulo-mediate4. Questo meccanismo è dovuto principalmente alla presenza di Mycobacterium tuberculosis ucciso emulsionato nell’olio, i cui componenti forniscono un forte stimolo per il sistema immunitario5. Infatti, l’induzione di EAE è direttamente correlata alla quantità di micobatterio presente durante la sfida antigenica6.
L’aggiunta di altri micobatteri uccisi, come il Mycobacterium butyricum, all’adiuvante7 incompleto di Freund, così come l’effetto delle combinazioni adiuvanti8, possono modulare il decorso clinico dell’EAE e di conseguenza influenzare la riproducibilità dei risultati. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), l’agente eziologico della malattia di Johne nei ruminanti, è stato associato a disturbi infiammatori del SNC umano 9, poiché i suoi componenti antigenici sono in grado di suscitare una forte risposta umorale e cellulo-mediata in pazienti con sclerosi multipla e neuromielite ottica dello spettro9. Pertanto, in questo protocollo, mostriamo un metodo alternativo e riproducibile per indurre MOG-EAE sostituendo M. tuberculosis in CFA con M. paratuberculosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo dimostrato un robusto protocollo alternativo per indurre attivamente EAE grave in topi C57BL / 6J utilizzando il peptide MOG35-55 emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis10. L’induzione di EAE con questo metodo ha provocato una malattia più grave di quella indotta dal protocollo comune con CFA. Questa differenza potrebbe essere dovuta alle diverse componenti lipidiche nella parete cellulare dei micobatteri11. Infatti, a differe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro ha ricevuto il sostegno di una sovvenzione della Società giapponese per la promozione della scienza (sovvenzione n. JP 23K14675).
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
Riferimenti
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