Här presenterar vi ett alternativt protokoll för att aktivt inducera experimentell autoimmun encefalomyelit hos C57BL/6-möss, med användning av det immunogena epitopmyelinoligodendrocytglykoproteinet (MOG)35-55 suspenderat i ofullständig Freunds adjuvans innehållande den värmedödade Mycobacterium avium-underarten paratuberkulos.
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) inducerad av myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) kräver immunisering av en MOG-peptid emulgerad i fullständigt Freunds adjuvans (CFA) innehållande inaktiverad Mycobacterium tuberculosis. De antigena komponenterna i mykobakterien aktiverar dendritiska celler för att stimulera T-celler att producera cytokiner som främjar Th1-svaret via tollliknande receptorer. Därför är mängden och arten av mykobakterier som finns under den antigena utmaningen direkt relaterade till utvecklingen av EAE. Detta metodpapper presenterar ett alternativt protokoll för att inducera EAE i C57BL / 6-möss med hjälp av en modifierad ofullständig Freunds adjuvans innehållande den värmedödade Mycobacterium avium-underarten paratuberculosis stam K-10.
M. paratuberculosis, en medlem av Mycobacterium avium-komplexet, är orsakssambandet till Johnes sjukdom hos idisslare och har identifierats som en riskfaktor för flera humana T-cellmedierade störningar, inklusive multipel skleros. Sammantaget visade möss immuniserade med Mycobacterium paratuberculosis tidigare debut och större sjukdomssvårighetsgrad än möss immuniserade med CFA innehållande stammen av M. tuberculosis H37Ra vid samma doser på 4 mg / ml. De antigena determinanterna för Mycobacterium avium-underarten paratuberculosis (MAP) stam K-10 kunde inducera ett starkt Th1-cellulärt svar under effektorfasen, kännetecknat av signifikant högre antal T-lymfocyter (CD4 + CD27 +), dendritiska celler (CD11c + I-A / I-E +) och monocyter (CD11b + CD115 +) i mjälten jämfört med möss immuniserade med CFA. Vidare verkade det proliferativa T-cellssvaret på MOG-peptiden vara högst hos M. paratuberkulosimmuniserade möss. Användning av en encefalitogen (t.ex. MOG35-55) emulgerad i ett adjuvans innehållande M. paratuberculosis i formuleringen kan vara en alternativ och validerad metod för att aktivera dendritiska celler för priming av myelinepitopspecifika CD4+ T-celler under induktionsfasen av EAE.
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en vanlig modell för studier av humana demyeliniserande störningar1. Det finns flera modeller av EAE: aktiv immunisering med olika myelinpeptider i kombination med potenta adjuvanser, passiv immunisering genom in vitro-överföring av myelinspecifika CD4+ lymfocyter och transgena modeller av spontan EAE2. Var och en av dessa modeller har specifika funktioner som gör att olika aspekter av EAE kan studeras, såsom start, effektorfas eller kronisk fas. Myelinoligodendrocytglykoproteinmodellen (MOG) av EAE är en bra modell för att studera de immunmedierade mekanismerna för kronisk neuroinflammation och demyelinisering, eftersom den kännetecknas av mononukleär inflammatorisk infiltration, demyelinisering i perifer vit substans och minskad återhämtning efter sjukdomen topp1.
MOG-EAE induceras genom immunisering av känsliga möss med peptiden MOG35-55 i fullständigt Freunds adjuvans (CFA), följt av en intraperitoneal injektion av kikhostetoxin. Detta ökar permeabiliteten hos blod-hjärnbarriären och tillåter myelinspecifika T-celler aktiverade i periferin att nå centrala nervsystemet (CNS), där de kommer att reaktiveras3. CFA spelar en nyckelroll i induktionen av EAE genom att förbättra antigenupptaget av antigenpresenterande celler och uttrycket av cytokiner relaterade till humoral- och cellmedierade svar4. Denna mekanism beror huvudsakligen på närvaron av dödad Mycobacterium tuberculosis emulgerad i olja, vars komponenter ger en stark stimulans för immunsystemet5. Faktum är att induktionen av EAE är direkt relaterad till mängden mykobakterie närvarande under den antigena utmaningen6.
Tillägg av andra dödade mykobakterier, såsom Mycobacterium butyricum, till ofullständig Freunds adjuvans7, liksom effekten av adjuvanskombinationer8, kan modulera det kliniska förloppet av EAE och följaktligen påverka resultatens reproducerbarhet. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), det etiologiska medlet för Johnes sjukdom hos idisslare, har associerats med inflammatoriska störningar i humant CNS 9, eftersom dess antigena komponenter kan framkalla ett starkt humoralt och cellmedierat svar hos patienter med multipel skleros och neuromyelit optica spectrum disorder9. Därför visar vi i detta protokoll en alternativ och reproducerbar metod för att inducera MOG-EAE genom att ersätta M. tuberculosis i CFA med M. paratuberculosis.
Vi demonstrerade ett robust alternativt protokoll för att aktivt inducera svår EAE i C57BL / 6J-möss med peptiden MOG35-55 emulgerad i ett adjuvans innehållande M. paratuberculosis10. Induktionen av EAE med denna metod resulterade i en allvarligare sjukdom än den som inducerades av det gemensamma protokollet med CFA. Denna skillnad kan bero på de olika lipidkomponenterna i mykobakteriernas cellvägg11. I själva verket, till skillnad från andra my…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick stöd från ett bidrag från Japanese Society for the promotion of Science (bidrag nr. JP 23K14675).
anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |