Summary
Den farmakologiske målretning af ionkanaler er en lovende tilgang til behandling af solide tumorer. Der gives detaljerede protokoller til karakterisering af ionkanalfunktion i kræftceller og analyse af virkningerne af ionkanalmodulatorer på kræftlevedygtighed.
Abstract
Ionkanaler er kritiske for celleudvikling og vedligeholdelse af cellehomeostase. Perturbation af ionkanalfunktion bidrager til udviklingen af en bred vifte af lidelser eller kanalopatier. Kræftceller bruger ionkanaler til at drive deres egen udvikling, såvel som at forbedre sig som en tumor og assimilere i et mikromiljø, der omfatter forskellige ikke-kræftceller. Desuden kan stigninger i niveauer af vækstfaktorer og hormoner i tumormikromiljøet resultere i forbedret ionkanalekspression, hvilket bidrager til kræftcelleproliferation og overlevelse. Således er den farmakologiske målretning af ionkanaler potentielt en lovende tilgang til behandling af faste maligniteter, herunder primær og metastatisk hjernekræft. Heri beskrives protokoller til karakterisering af ionkanalernes funktion i kræftceller og tilgange til analyse af modulatorer af ionkanaler for at bestemme deres indvirkning på kræftlevedygtigheden. Disse omfatter farvning af en celle (er) til en ionkanal (er), test af mitokondriernes polariserede tilstand, etablering af ionkanalfunktion ved hjælp af elektrofysiologi og udførelse af levedygtighedsanalyser for at vurdere lægemiddelstyrke.
Introduction
Membrantransportproteiner er kritiske for kommunikation mellem celler såvel som for at opretholde cellulær homeostase. Blandt membrantransportproteinerne tjener ionkanaler til at drive vækst og udvikling af celler og til at opretholde cellernes tilstand i udfordrende og skiftende miljøer. Ionkanaler er også rapporteret at drive og understøtte udviklingen af solide tumorer, både systemisk og i centralnervesystemet (CNS)1,2. For eksempel er KCa3.1-kanaler ansvarlige for regulering af membranpotentiale og styring af cellevolumen, hvilket er vigtigt i cellecyklusregulering. Defekte KCa3.1 kanaler er blevet rapporteret at bidrage til unormal spredning af tumorceller3. Endvidere kan ionkanaler bidrage til metastatisk spredning af kræftformer. Transiente receptorpotentielle (TRP) kanaler er for eksempel involveret i Ca 2+ og Mg2+ tilstrømning; Denne tilstrømning aktiverer flere kinaser og varmechokproteiner, der fungerer til at regulere den ekstracellulære matrix, der omgiver en tumor, hvilket igen er vigtigt for at initiere kræftmetastase4.
Da ionkanaler kan bidrage til udviklingen af kræft, kan de også være mål for lægemiddelrelateret kræftbehandling. For eksempel er resistens over for behandlingsmetoder, herunder kemoterapi og ny immunterapi, relateret til ionkanalfunktionsdysregulering 5,6,7. Derudover fremstår ionkanaler som vigtige lægemiddelmål for at hindre vækst og udvikling af kræftformer, hvor genanvendte lægemidler med små molekyler (FDA-godkendte) undersøges såvel som biopolymerer, herunder monoklonale antistoffer 1,2,8,9. Mens der har været store fremskridt på denne front, er opdagelsen af ionkanalkræftmedicin fortsat underudviklet. Dette skyldes blandt andet de unikke udfordringer ved at studere ionkanaler i kræftceller. For eksempel er der tekniske begrænsninger i opsætning af elektrofysiologiske assays for langsomt virkende forbindelser og tidsmæssige forskelle i kanalaktivering og lægemiddelvirkning. Endvidere kan opløseligheden af forbindelser også hæmme fremskridt, da de fleste af de automatiserede elektrofysiologiske systemer, der almindeligvis anvendes i dag, bruger hydrofobe substrater, hvilket kan bidrage til artefakter som følge af sammensat adsorption. Derudover er store bioorganiske molekylære lægemidler såsom naturlige produkter, peptider og monoklonale antistoffer teknisk udfordrende at screene ved hjælp af konventionelle elektrofysiologiske assays10. Endelig forbliver kræftcellernes bioelektriske egenskaber dårligt forstået11.
I mellemtiden er immunofluorescensfarvning af ionkanaler ofte udfordrende. Dette skyldes til dels kompleksiteten af deres strukturer og deres kontekst i membranen, som påvirker evnen til både at generere og anvende antistoffer til mikroskopiundersøgelser. Det er især vigtigt, at de antistoffer, der bruges til at plette ionkanaler, valideres for specificitet, affinitet og reproducerbarhed. Kommercielle antistoffer mod ionkanaler bør overvejes på grundlag af deres valideringsstrategi og offentliggørelseshistorik. Eksperimenter bør omfatte negative kontroller for at demonstrere manglen på uspecifik binding ved enten knockdown eller knockout af målproteinet. Alternativt kan cellelinjer, hvor målproteinet er fraværende eller i lav forekomst baseret på mRNA eller proteinbestemmelser, tjene som negative kontroller. For eksempel viser denne undersøgelse lokalisering af (GABA) receptorunderenheden Gabra5 i en medulloblastomcellelinje (D283). D283-celler med en siRNA-knockdown og Daoy-celler, en anden cerebellær medulloblastomcellelinje, blev farvet for Gabra5 og viste ingen mærkbar farvning (data ikke vist).
Her præsenteres metoder til analyse og analyse af ionkanalfunktion samt effekten af ionkanalmodulatorer på kræftceller. Der er fastsat protokoller for (1) farvning af celler til en ionkanal, (2) test af mitokondriernes polariserede tilstand, (3) etablering af ionkanalfunktion ved hjælp af elektrofysiologi og (4) di vitro-lægemiddelvalidering. Disse protokoller understreger undersøgelser af type A gamma-aminosmørsyre (GABAA) receptor 2,12,13,14,15,16, en chloridanionkanal og større hæmmende neurotransmitterreceptor. De metoder, der præsenteres her, gælder imidlertid for at studere mange andre kræftceller og ionkanaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ændringer i ionkanalfunktionen ændrer intracellulære signalkaskader, hvilket kan påvirke en celles overordnede funktion. I løbet af det sidste årti er det blevet mere og mere klart, at ionkanaler er vigtige for kræftcellevækst og metastase. Det er vigtigt, at mange ionkanaler er primære mål for godkendte behandlinger rettet mod en bred vifte af lidelser24. Efterforskere har undersøgt, om ionkanaler kunne være anti-cancer mål, og de første resultater er lovende 2,16,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender støtte fra Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation til SS og Harold C. Schott Foundation finansiering af Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, til SS.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
Riferimenti
- Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
- Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
- Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
- Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
- Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
- Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
- Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
- Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
- Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
- Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
- Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
- Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
- Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
- Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
- Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
- Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
- Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
- Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
- Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
- Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
- Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
- Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
- Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
- Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
- Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Ricerca sul cancro. 48 (17), 4827-4833 (1988).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Ricerca sul cancro. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
- Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
- Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).
