Perfiles genéticos y cribado de abandono a escala genómica para identificar dianas terapéuticas en modelos murinos de tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos
Summary
Hemos desarrollado un enfoque de oncogenómica comparativa entre especies que utiliza análisis genómicos y cribados genómicos funcionales para identificar y comparar dianas terapéuticas en tumores que surgen en modelos de ratón modificados genéticamente y el tipo de tumor humano correspondiente.
Abstract
Los tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST, por sus siglas en inglés) se derivan de las células de Schwann o de sus precursores. En los pacientes con el síndrome de susceptibilidad tumoral neurofibromatosis tipo 1 (NF1), las MPNST son la neoplasia maligna más común y la principal causa de muerte. Estos sarcomas de tejidos blandos raros y agresivos ofrecen un futuro sombrío, con tasas de supervivencia libre de enfermedad a 5 años del 34-60%. Las opciones de tratamiento para las personas con MPNST son decepcionantemente limitadas, siendo la cirugía desfigurante la principal opción de tratamiento. Muchas terapias que alguna vez fueron prometedoras, como el tipifarnib, un inhibidor de la señalización de Ras, han fracasado clínicamente. Del mismo modo, los ensayos clínicos de fase II con erlotinib, que se dirige al factor de crecimiento epidérmico (EFGR), y sorafenib, que se dirige al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), al receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y a Raf, en combinación con la quimioterapia estándar, tampoco han logrado producir una respuesta en los pacientes.
En los últimos años, los métodos de cribado genómico funcional combinados con el perfil genético de líneas celulares cancerosas han demostrado ser útiles para identificar vías esenciales de señalización citoplasmática y el desarrollo de terapias específicas para dianas. En el caso de los tipos de tumores raros, una variación de este enfoque conocida como oncogenómica comparativa entre especies se utiliza cada vez más para identificar nuevas dianas terapéuticas. En la oncogenómica comparativa entre especies, los perfiles genéticos y la genómica funcional se realizan en modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) y los resultados se validan en las raras muestras humanas y líneas celulares disponibles.
En este artículo se describe cómo identificar mutaciones candidatas de genes impulsores en células MPNST humanas y de ratón mediante secuenciación del exoma completo (WES). A continuación, describimos cómo realizar cribados de shRNA a escala genómica para identificar y comparar vías de señalización críticas en células MPNST de ratón y humanas e identificar dianas farmacológicas en estas vías. Estas metodologías proporcionan un enfoque eficaz para identificar nuevas dianas terapéuticas en una variedad de tipos de cáncer humano.
Introduction
Los tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST) son neoplasias de células fusiformes altamente agresivas que surgen en asociación con el síndrome de susceptibilidad tumoral neurofibromatosis tipo 1 (NF1), esporádicamente en la población general y en sitios de radioterapia previa 1,2,3. Los pacientes con NF1 nacen con una copia de tipo natural del gen supresor de tumores NF1 y un segundo alelo NF1 con una mutación de pérdida de función. Este estado de haploinsuficiencia hace que los pacientes con NF1 sean susceptibles a una segunda mutación de pérdida de función en su gen NF1 de tipo natural, lo que desencadena la tumorigénesis. Cuando esta mutación NF1 de “segundo golpe” ocurre en una célula del linaje de células de Schwann, el tumor resultante es un neurofibroma dérmico que surge en la piel o un neurofibroma plexiforme que se desarrolla en nervios grandes o plexos nerviosos. Aunque la patología de los neurofibromas dérmicos y plexiformes es idéntica, su comportamiento biológico es bastante diferente: aunque tanto los neurofibromas dérmicos como los plexiformes son benignos, solo los neurofibromas plexiformes pueden sufrir transformación y dar lugar a MPNST. Además de la pérdida de neurofibromina, la proteína activadora de la GTPasa Ras codificada por el gen NF1, los MPNST portan mutaciones de muchos otros genes supresores de tumores, incluidos TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 y PTEN 10, mutaciones de genes que codifican componentes del complejo represivo polycomb 2 11,12 (PRC2 ; el SUZ12 y EED) y expresión aberrante del receptor tirosina quinasas 1,2. Las mutaciones de NF1 y de los otros genes mencionados anteriormente también están presentes en MPNST esporádicas e inducidas por radiación11,12.
Si bien estos avances en nuestra comprensión de las anomalías genómicas en los MPNST han sido invaluables para comprender su patogénesis, aún no han dado lugar al desarrollo de nuevas terapias efectivas para los MPNST. Un obstáculo importante que impide el desarrollo de nuevos tratamientos es el hecho de que los MPNST son cánceres raros. Debido a esto, es difícil obtener la gran cantidad de muestras de pacientes que se requieren para los análisis globales que definen mutaciones impulsoras clave, como los realizados por The Cancer Genome Atlas (TCGA). En nuestra experiencia, acumular incluso un número modesto de especímenes humanos de MPNST puede llevar años. Para superar estas limitaciones, muchos investigadores que estudian otros tipos de cáncer raros han recurrido al uso de la oncogenómica comparativa entre especies para identificar mutaciones genéticas conductoras esenciales, definir las vías de señalización citoplasmática esenciales en su tumor de interés e identificar nuevas dianas terapéuticas. Dado que las vías de señalización que son esenciales para la tumorigénesis están altamente conservadas entre los seres humanos y otras especies de vertebrados, la aplicación de enfoques de genómica funcional, como las pruebas de detección de shRNA a escala genómica, puede ser un medio eficaz para identificar estas nuevas mutaciones impulsoras, vías de señalización y dianas terapéuticas 13,14,15,16,17,18,19 , especialmente cuando se estudian tipos de tumores humanos raros que están disponibles en cantidades limitadas20.
En las metodologías aquí presentadas, describimos este enfoque para realizar perfiles genómicos en líneas celulares humanas de MPNST y cultivos de MPNST de paso temprano derivados de ratones P 0-GGFβ3, un modelo de ratón modificado genéticamente (GEM) en el que la sobreexpresión específica de células de Schwann del factor de crecimiento neuregulina-1 (NRG1) promueve la patogénesis de los neurofibromas plexiformes y su posterior progresión a MPNST21, 22,23. El primer paso en este enfoque es identificar genes impulsores candidatos en MPNST P 0-GGFβ3, líneas celulares de MPNST humanas y MPNST humanas resecadas quirúrgicamente. Para validar funcionalmente las vías de señalización afectadas por estas mutaciones, utilizamos cribados de shRNA a escala genómica para identificar los genes necesarios para la proliferación y la supervivencia en líneas celulares MPNST humanas y de ratón. Después de identificar los genes necesarios para la proliferación y la supervivencia, identificamos los productos génicos farmacológicos dentro de la colección de “hits” utilizando la Base de Datos de Interacción Farmacogen-Genio. También comparamos los “hits” en células MPNST humanas y de ratón, para determinar si el modelo GEM y las MPNST humanas demuestran una dependencia similar de los mismos genes y vías de señalización. La identificación de solapamientos en los genes necesarios para la proliferación y la supervivencia y las vías de señalización afectadas sirve como medio para validar el modelo de ratón P 0-GGFβ3 a nivel molecular. Este enfoque también hace hincapié en la eficacia de la combinación de cribas humanas y de ratón para identificar nuevas dianas terapéuticas, en las que el modelo de ratón puede servir como complemento de las cribas humanas. El valor de este enfoque entre especies es particularmente evidente cuando se buscan dianas terapéuticas en tumores raros, donde los tumores humanos y las líneas celulares son difíciles de obtener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos detallados que se presentan aquí se desarrollaron para estudiar la neoplasia del sistema nervioso periférico y la patogénesis de MPNST. Aunque hemos encontrado que estos métodos son efectivos, debe reconocerse que existen algunas limitaciones potenciales para los métodos que describimos aquí. A continuación, discutimos algunas de esas limitaciones y las posibles estrategias para superarlas en otros sistemas modelo.
Hemos encontrado que la secuenciación del exoma completo i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (R01 NS048353 y R01 NS109655 a S.L.C.; R01 NS109655-03S1 a D.P.J.), el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA122804 a S.L.C.) y el Departamento de Defensa (X81XWH-09-1-0086 y W81XWH-12-1-0164 a S.L.C.).
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
Riferimenti
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