Ufraksjonert Bulk Kultur av mus skjelettmuskulatur å rekapitulere nisje og stamcelle quiescence

Summary

Skjelettmuskulatur består av flere celletyper, inkludert bosatt stamceller, hver med et spesielt bidrag til muskelhomeostase og regenerering. Her beskrives 2D-kulturen av muskelstamceller og muskelcellenisjen i en ex vivo-setting som bevarer mange av de fysiologiske, in vivo og miljømessige egenskapene.

Abstract

Skjelettmuskulatur er det største vevet i kroppen og utfører flere funksjoner, fra bevegelse til kroppstemperaturkontroll. Dens funksjonalitet og utvinning fra skader avhenger av en rekke celletyper og på molekylære signaler mellom kjernemuskelcellene (myofibre, muskelstamceller) og deres nisje. De fleste eksperimentelle innstillinger bevarer ikke dette komplekse fysiologiske mikromiljøet, og de tillater heller ikke ex vivo-studien av muskelstamceller i hvile, en celletilstand som er avgjørende for dem. Her er en protokoll skissert for ex vivo-kulturen av muskelstamceller med cellulære komponenter i deres nisje. Gjennom mekanisk og enzymatisk nedbrytning av muskler oppnås en blanding av celletyper, som settes i 2D-kultur. Immunofarging viser at innen 1 uke er flere nisjeceller tilstede i kultur sammen med myofibre og, viktigere, Pax7-positive celler som viser egenskapene til hvilende muskelstamceller. Disse unike egenskapene gjør denne protokollen til et kraftig verktøy for celleforsterkning og generering av hvilelignende stamceller som kan brukes til å løse grunnleggende og translasjonsspørsmål.

Introduction

Bevegelse, pust, metabolisme, kroppsstilling og vedlikehold av kroppstemperatur er alle avhengige av skjelettmuskulatur, og funksjonsfeil i skjelettmuskulaturen kan dermed forårsake svekkende patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier, etc.) ¹. Gitt sine essensielle funksjoner og overflod, har skjelettmuskulatur trukket oppmerksomheten til forskningslaboratorier over hele verden som streber etter å forstå de viktigste aspektene som støtter normal muskelfunksjon og kan tjene som terapeutiske mål. I tillegg er skjelettmuskulatur en mye brukt modell for å studere regenerering og stamcellefunksjon, da sunn muskel kan fullstendig reparere seg selv etter fullstendig skade og degenerasjon, hovedsakelig på grunn av de bosatte stamceller²; Disse kalles også satellittceller og er lokalisert under basal lamina i periferien av muskelfibrene³.

Kjernecellene i voksen skjelettmuskulatur er myofibrene (lange syncytiale multinukleære celler) og satellittcellene (stamceller med myogent potensial som hviler til en skade aktiverer dem). De sistnevnte cellene er de sentrale cellene i muskelregenerering, og denne prosessen kan ikke forekomme i deres fravær 4,5,6,7. I deres umiddelbare mikromiljø er det flere celletyper og molekylære faktorer som signaliserer til dem. Denne nisjen etableres gradvis gjennom utviklingen og frem til voksen alder⁸. Voksen muskel inneholder flere celletyper (endotelceller, pericytter, makrofager, fibro-adipogene progenitorer-FAPs, regulatoriske T-celler, etc.) ^9,10 og ekstracellulære matrikskomponenter (lamininer, kollagen, fibronektin, fibrilliner, periostin, etc.) ¹¹ som samhandler med hverandre og med satellittcellene i sammenheng med helse, sykdom og regenerering.

Å bevare denne komplekse nisjen i eksperimentelle omgivelser er grunnleggende, men utfordrende. Like vanskelig er det å opprettholde eller gå tilbake til hvile, en celletilstand som er kritisk for satellittceller⁹. Flere metoder har blitt introdusert for delvis å takle disse utfordringene, hver med sine fordeler og ulemper (detaljert i diskusjonsdelen). Her presenteres en metode som delvis kan overvinne disse to barrierene. Muskler blir først høstet og deretter brutt ned mekanisk og enzymatisk før den heterogene celleblandingen settes i kultur. I løpet av kulturen oppdages mange celletyper av nisje, og satellittceller som har returnert til stillhet, observeres. Som et siste trinn i protokollen presenteres immunfluorescenstrinnene som muliggjør deteksjon av hver celletype ved bruk av universelt aksepterte markører.

Protocol

Alle eksperimenter overholdt franske og EUs dyreforskrifter ved Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), spesielt direktivet 2010/63/UE. Dyrene ble holdt i et kontrollert og beriket miljø ved dyreavdelingene med sertifiseringsnummer A94 028 379 og D94-028-028; De ble kun håndtert av autoriserte forskere og dyrepassere, og de ble visuelt inspisert av dyrehuspersonell for tegn på ubehag i løpet av livet. De ble avlivet ved cervikal dislokasjon før disseksjon. Ingen intervensjonsprosedyrer ble utført i…

Representative Results

Denne protokollen tillater muskelcellekultur samtidig som satellittcellene og de fleste celler bevares fra deres endogene nisje. Figur 2 oppsummerer hovedtrinnene i protokollen, mens vesentlige deler av disseksjonen og fordøyelsen er presentert i figur 1. Disseksjon av bakkroppsmuskulaturen anbefales (figur 1A-C), da denne muskelgruppen er godt studert og deler utviklingsmessig opprinnelse og molek…

Discussion

Voksen skjelettmuskelfunksjon støttes av et fint orkestrert sett med cellulære interaksjoner og molekylære signaler. Her presenteres en metode som gjør det mulig å studere disse parametrene i en ex vivo-setting som ligner det fysiologiske mikromiljøet.

Flere grupper har rapportert in vitro-metoder for dyrkning av myogene celler. Disse metodene hadde som mål å isolere satellittceller for å studere deres myogene stamegenskaper. To hovedtilnærminger brukes til å isole…

Materials

anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj