Polymerasekjedereaksjon og dot-blot-hybridisering for Leptospira-deteksjon i vannprøver

Summary

I denne studien ble en dot-blot-applikasjon designet for å oppdage Leptospira fra de tre hovedkladene i vannprøver. Denne metoden tillater identifisering av minimale DNA-mengder spesifikt målrettet av en digoksigenin-merket sonde, lett detekteres av et anti-digoksigeninantistoff. Denne tilnærmingen er et verdifullt og tilfredsstillende verktøy for screeningformål.

Abstract

Dot-blot er en enkel, rask, sensitiv og allsidig teknikk som muliggjør identifisering av minimale mengder DNA spesifikt målrettet ved sondehybridisering i nærvær av bærer-DNA. Den er basert på overføring av en kjent mengde DNA til en inert fast støtte, slik som en nylonmembran, ved bruk av dot-blot-apparatet og uten elektroforetisk separasjon. Nylonmembraner har fordelen av høy nukleinsyrebindingskapasitet (400 μg / cm²), høy styrke, og er positivt eller nøytralt ladet. Sonden som brukes er et svært spesifikt ssDNA-fragment på 18 til 20 baser som lenge er merket med digoksigenin (DIG). Sonden vil konjugere med Leptospira DNA. Når sonden har hybridisert med mål-DNA, detekteres den av et anti-digoksigeninantistoff, slik at den enkelt kan detekteres gjennom utslippene som avsløres i en røntgenfilm. Prikkene med en utslipp vil tilsvare DNA-fragmentene av interesse. Denne metoden benytter sondens ikke-isotopiske merking, som kan ha en svært lang halveringstid. Ulempen med denne standard immunetiketten er en lavere følsomhet enn isotopiske prober. Likevel reduseres det ved kobling av polymerasekjedereaksjon (PCR) og dot-blot-analyser. Denne tilnærmingen muliggjør berikelse av målsekvensen og dens deteksjon. I tillegg kan den brukes som en kvantitativ applikasjon sammenlignet med en seriell fortynning av en velkjent standard. En dot-blot-applikasjon for å oppdage Leptospira fra de tre hovedkladene i vannprøver presenteres her. Denne metoden kan brukes på store mengder vann når de har blitt konsentrert ved sentrifugering for å gi bevis på tilstedeværelsen av leptospiralt DNA. Dette er et verdifullt og tilfredsstillende verktøy for generelle screeningformål, og kan brukes til andre ikke-dyrkbare bakterier som kan være tilstede i vann, noe som øker forståelsen av økosystemet.

Introduction

Leptospirose hos mennesker stammer hovedsakelig fra miljøkilder ^1,2. Tilstedeværelsen av Leptospira i innsjøer, elver og bekker er en indikator på leptospiroseoverføring blant dyreliv og husdyr og produksjonsdyr som til slutt kan komme i kontakt med disse vannmassene ^1,3,4. Videre har Leptospira blitt identifisert i ikke-naturlige kilder, inkludert kloakk, stillestående og vann fra springen ^5,6.

Leptospira er en verdensomspennende distribuert bakterie ^7,8, og miljøets rolle i bevaring og overføring har blitt godt anerkjent. Leptospira kan overleve i drikkevann under variabel pH og mineraler⁹, og i naturlige vannmasser¹. Den kan også overleve i lange perioder i destillert vann¹⁰, og under konstant pH (7,8) kan den overleve opptil 152 dager¹¹. Videre kan Leptospira samhandle i bakterielle konsortier for å overleve tøffe forhold^12,13. Det kan være en del av biofilm i ferskvann med Azospirillum og Sphingomonas og er til og med i stand til å vokse og tåle temperaturer over 49 ° C^14,15. Det kan også formere seg i vannmettet jord og forbli levedyktig i opptil 379 dager¹⁶, og bevare sin evne til å forårsake sykdommen så lenge som et år^17,18. Imidlertid er lite kjent om økologien i vannlegemer og hvordan den er fordelt i dem.

Siden oppdagelsen var studien av slekten Leptospira basert på serologiske tester. Det var ikke før det nåværende århundre at molekylære teknikker ble mer utbredt i studiet av denne spirochaete. Dot-blot har knapt blitt brukt til identifikasjon ved hjelp av (1) en isotopisk sonde basert på 16S rRNA og på en inter-enkel sekvensrepetisjon (ISSR) ^19,20, (2) som en nanogoldbasert immunoassay for human leptospirose anvendt på urin²¹, eller (3) som en antistoffbasert analyse for storfe urinprøver²². Teknikken falt ut av bruk fordi den opprinnelig var basert på isotopiske prober. Det er imidlertid en velkjent teknikk som, kombinert med PCR, gir forbedrede resultater, og det anses som trygt på grunn av bruk av ikke-isotopiske prober. PCR spiller en avgjørende rolle i anrikningen av Leptospira DNA ved å amplifisere et spesifikt DNA-fragment som kan finnes i spormengder i en prøve. Under hver PCR-syklus dobles mengden av det målrettede DNA-fragmentet i reaksjonen. På slutten av reaksjonen har amplikonen blitt multiplisert med en faktor på mer enn en million²³. Produktet forsterket av PCR, ofte ikke synlig i agaroseelektroforese, blir synlig gjennom spesifikk hybridisering med en DIG-merket sonde i dot-blot 24,25,26.

Dot-blot-teknikken er enkel, robust og egnet for mange prøver, noe som gjør den tilgjengelig for laboratorier med begrensede ressurser. Det har blitt brukt i en rekke bakteriestudier, inkludert (1) orale bakterier²⁷, (2) andre prøvetyper som mat og avføring²⁸, og (3) identifisering av unculturable bakterier²⁹, ofte i samsvar med andre molekylære teknikker. Blant fordelene som tilbys av dot-blot-teknikken er: (1) Membranen har en høy bindingskapasitet, i stand til å binde over 200 μg / cm² nukleinsyrer og opptil 400 μg / cm²; (2) Dot-blot-resultater kan tolkes visuelt uten å kreve spesialutstyr, og (3) de kan enkelt lagres i årevis ved romtemperatur (RT).

Slekten Leptospira har blitt klassifisert i patogene, mellomliggende og saprofytiske klader^30,31. Skillet mellom disse kladene kan oppnås basert på spesifikke gener som lipL41, lipL32 og 16S rRNA. LipL32 er tilstede i de patogene kladene og utviser høy sensitivitet i ulike serologiske og molekylære verktøy, mens den er fraværende i saprofyttarter²¹. Housekeeping-genet lipL41 er kjent for sitt stabile uttrykk og brukes i molekylære teknikker³², mens 16S rRNA-genet brukes til klassifisering.

Denne metoden kan brukes på store mengder vann når de har blitt konsentrert ved sentrifugering. Det tillater vurdering av ulike punkter og dybder i en vannkropp for å oppdage tilstedeværelsen av leptospiralt DNA og kladen som den tilhører. Dette verktøyet er verdifullt for både økologiske og generelle screeningformål, og kan også brukes til å oppdage andre ikke-dyrkbare bakterier som kan være tilstede i vann.

I tillegg er PCR- og dot-blot-analyser teknisk og økonomisk rimelige for et bredt spekter av laboratorier, selv de som mangler sofistikert eller dyrt utstyr. Denne studien tar sikte på å anvende digoksigeninbasert dot-blot for identifisering av de tre Leptospira-klader i vannprøver samlet fra naturlige vannmasser.

Bakterielle stammer
Tolv Leptospira serovarer (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, og Wolffi) ble inkludert i denne studien. Disse serovarene er en del av samlingen ved Institutt for mikrobiologi og immunologi, Fakultet for veterinærmedisin og zooteknikk, National Autonomous University of Mexico, og de brukes for tiden i mikroagglutineringstesten (LAR).

Alle Leptospira serovarer ble dyrket i EMJH, og deres DNA ble ekstrahert ved hjelp av et kommersielt DNA-ekstraksjonssett (se materialtabell). En genomisk DNA-blanding av de tolv serovarene ble brukt som en positiv kontroll for den patogene kladen Leptospira . Som positiv kontroll av mellomkladen Leptospira ble genomisk DNA fra Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stamme BUT6 inkludert, og som positiv kontroll for Leptospira-saprofyttkladen ble også genomisk DNA fra Leptospira biflexa serovar Patoc-stammen Patoc I, inkludert.

Negative kontroller besto av et tomt plasmid, DNA fra ikke-relaterte bakterier (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii og Escherichia coli) og PCR-gradig vann, som fungerte som ikke-malkontroll.

Vannprøver
Tolv prøvetakingsprøver ble samlet inn ved hjelp av en stratifisert-tilfeldig prøvetakingsmetode fra Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16′ 54″ N 99° 6′ 11″ W). Disse prøvene ble tatt på tre dybder: overfladisk, 10 og 30 cm (figur 1A, B). Vanninnsamlingsprosedyrene påvirket ingen truede eller beskyttede arter. Hver prøve ble samlet i et sterilt 15 ml mikrosentrifugerør. For å samle prøven ble hvert rør forsiktig nedsenket i vannet, fylt på den valgte dybden og deretter forseglet. Prøvene ble oppbevart ved 22 °C og straks transportert til laboratoriet for behandling.

Hver prøve ble konsentrert ved sentrifugering i sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør ved 8000 x g i 20 minutter ved romtemperatur. Dette trinnet ble gjentatt til alle prøvene ble konsentrert i ett rør, som deretter ble brukt til DNA-ekstraksjon (figur 1C).

Figur 1: Konsentrasjon av vannprøver ved sentrifugering. (A) Vannprøvedammer, og (B) Naturlige bekker. (C) Sentrifugeringsbasert vannprøvebehandling i gjentatte trinn så mange ganger som nødvendig (n). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

DNA-ekstraksjon
Totalt DNA ble isolert ved hjelp av et kommersielt genomisk DNA-sett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). DNA-ekstraksjoner ble eluert i 20 μL elueringsbuffer, og DNA-konsentrasjon ble bestemt av et UV-spektrofotometer ved 260-280 nm, og lagret ved 4 °C til bruk.

PCR-amplifikasjon
PCR-målene var 16S rRNA-, lipL41- og lipL32-gener, som identifiserer DNA fra slekten Leptospira og tillater skillet mellom de tre kladene: patogen, saprofytisk og mellomliggende. Både primere og sondedesign var basert på tidligere arbeider av Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. og Branger et al.33,34,35,36,37. Sekvensen av hver sonde, primer og forsterkede fragment er beskrevet i tabell 1, og deres tilpasning til referansesekvenser er gitt i tilleggsfil 1, tilleggsfil 2, tilleggsfil 3, tilleggsfil 4 og tilleggsfil 5. PCR-reagensene og termosyklusforholdene er beskrevet i protokollavsnittet.

Forsterkningsprodukter ble visualisert ved elektroforetisk separasjon på en 1% agarosegel i TAE (40 mM Tris-base, 20 mM eddiksyre og 1 mM EDTA; pH 8,3), ved 60 V i 45 minutter med ethidiumbromiddeteksjon, som vist i tilleggsfigur 1. Genomisk DNA oppnådd fra hver serovar ble brukt med konsentrasjoner fra 6 x 10⁶ til 1 x 10⁴ genomiske ekvivalente kopier (GEq) i hver PCR-reaksjon, basert på genomstørrelsen til L. interrogans (4, 691, 184 bp) ³⁸ for patogen Leptospira, genomstørrelsen til L. biflexa (3, 956, 088 bp) ³⁹ for saprofytisk Leptospira, og genomstørrelsen til L. fainei serovar Hurstbridge-stamme BUT6 (4, 267, 324 bp) med tiltredelsesnummer AKWZ00000000.2.

Sensitiviteten til sondene ble vurdert med DNA fra hver patogen serovar, L. biflexa serovar Patoc stamme Patoc I og L. fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 i hvert eksperiment. For å vurdere spesifisiteten til PCR- og dot-blot-hybridiseringsanalysen ble DNA fra ikke-relaterte bakterier inkludert.

Tabell 1: PCR-primere og prober for å amplifisere produkter for å identifisere de patogene, saprofyte og mellomliggende klader av Leptospira. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Dot-blot hybridiseringsanalyse
Teknikken kalles dot-blot fordi hullene der DNA-prøven er plassert har en prikkform, og når de suges for å festes på plass ved vakuumsuging, får de denne formen. Denne teknikken ble utviklet av Kafatos et ^al.40. Teknikken tillater semi-kvantifisering av Leptospira i hver PCR-positiv prøve. Protokollen består av en denaturering med NaOH 0,4 M ved romtemperatur, prøver med Leptospira DNA fra 30 ng til 0,05 ng, tilsvarende 6 x 10⁶ til 1 x 10⁴ leptospirer, blir blottet på en nylonmembran med et 96-brønns dot-blot-apparat. Etter immobilisering er DNA bundet til membranen ved eksponering for 120 mJ UV-lys. Hver DNA-sonde er konjugert med digoksigenin-11 dUTP ved et terminalt transferasekatalysetrinn i 3′-enden (Digoxigenin er et plantesteroid oppnådd fra Digitalis purpurea, brukt som reporter⁴¹). Etter den strenge hybridiseringen av den merkede DNA-sonden (50 pmol) ved den spesifikke temperaturen på mål-DNA, visualiseres DNA-hybridene ved kjemiluminescensreaksjonen med det alkaliske fosfataseantistoffet mot digoksigenin kovalent konjugert med dets substrat CSPD. Luminescensen fanges opp ved eksponering for røntgenfilm (figur 2).

Figur 2: Trinn i prosedyren for PCR-dot-blot-analysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Forberedelse av prøver Konsentrer hver vannprøve i 1,5 ml mikrosentrifugerør ved sentrifugering ved 8000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Gjenta dette trinnet, så mange ganger som nødvendig, for å konsentrere prøven til et volum på 250 μL. Bruk DNA-ekstraksjonssettet i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). Utfør den spesifikke PCR i henhold til dot-blot-sonden som skal brukes (tabell 1).Utfør…

Representative Results

For å vurdere effektiviteten av teknikken ble genomisk DNA fra rene kulturer av hver Leptospira serovar brukt, sammen med den kladespesifikke sonden. Membraner ble fremstilt med 100 ng genomisk DNA per PCR-reaksjon for hver serovar, etterfulgt av åtte genomiske DNA av ikke-relaterte bakterier og variable konsentrasjoner av genomisk DNA av ad hoc Leptospira serovarer. Hver analyse inkluderte positiv, negativ og ikke-malkontroll. Disse ikke-relaterte genomiske DNA-ene viste ikke en affinitet for dot-blo…

Discussion

De kritiske trinnene i dot-blot-teknikken inkluderer (1) DNA-immobilisering, (2) blokkering av de frie bindingsstedene på membranen med ikke-homologt DNA, (3) komplementariteten mellom sonden og målfragmentet under glødningsbetingelser, (4) fjerning av den uhybridiserte sonden og (5) påvisning av reportermolekylet⁴¹.

PCR-Dot-blot har visse begrensninger, for eksempel at teknikken ikke gir informasjon om størrelsen på det hybridiserte fragmentet^37…

Materials

REAGENTS
Purelink DNA extraction kit	Invitrogen	K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)	Promega	M3001
Whatman filter paper, grade 1,	Merk	WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m	Roche	11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody	Roche	11093274910
Medium Base EMJH	Difco	S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH	Difco	BD 279510
Blocking Reagent	Roche	11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate	Merk	11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma Aldrich	D3159
Developer Carestream	Carestream Health Inc	GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP	Roche	11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)	Promega	H5032
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F8016
Fixer Carestream	Carestream Health Inc	GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa	Sigma Aldrich	L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa	Sigma Aldrich	L-9150	It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)	Sigma Aldrich	PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)	Sigma Aldrich	9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Terminal transferase, recombinant	Roche	3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)	Sigma-Aldrich	1185-53-1
SSPE 20X	Sigma-Aldrich	S2015-1L	It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Probes	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer	Thermo-Scientific	ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm	Sigma-Aldrich	1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl	Gilson	SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl	Axygen	T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl	Axygen	TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot	BIORAD	1706545
Portable Hergom Suction	Hergom	7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)	Hoefer	PH90-115V
UV Crosslinker	Hoefer	UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler	Hybaid	HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17	Fuji