I siti di contatto mitocondriali sono complessi proteici che interagiscono con le proteine della membrana interna ed esterna mitocondriale. Questi siti sono essenziali per la comunicazione tra le membrane mitocondriali e, quindi, tra il citosol e la matrice mitocondriale. In questo articolo, descriviamo un metodo per identificare i candidati che si qualificano per questa specifica classe di proteine.
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Articolo metodologico
Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri sono presenti praticamente in tutte le cellule eucariotiche e svolgono funzioni essenziali che vanno ben oltre la produzione di energia, ad esempio la sintesi di cluster ferro-zolfo, lipidi o proteine, il tamponamento di Ca2+ e l'induzione dell'apoptosi. Allo stesso modo, la disfunzione mitocondriale provoca gravi malattie umane come il cancro, il diabete e la neurodegenerazione. Per svolgere queste funzioni, i mitocondri devono comunicare con il resto della cellula attraverso il loro involucro, che consiste di due membrane. Pertanto, queste due membrane devono interagire costantemente. I siti di contatto proteici tra la membrana mitocondriale interna ed esterna sono essenziali in questo senso. Finora sono stati identificati diversi siti di contatto. Nel metodo qui descritto, i mitocondri di Saccharomyces cerevisiae vengono utilizzati per isolare i siti di contatto e, quindi, identificare i candidati che si qualificano per le proteine del sito di contatto. Abbiamo usato questo metodo per identificare il complesso MICOS (Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System), uno dei principali complessi di formazione del sito di contatto nella membrana interna mitocondriale, che si conserva dal lievito all'uomo. Recentemente, abbiamo ulteriormente migliorato questo metodo per identificare un nuovo sito di contatto costituito da Cqd1 e dal complesso Por1-Om14.
Introduzione
I mitocondri svolgono una varietà di funzioni diverse negli eucarioti, la più nota delle quali è la produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Altre funzioni includono la produzione di cluster ferro-zolfo, la sintesi lipidica e, negli eucarioti superiori, la segnalazione di Ca2+ e l'induzione dell'apoptosi 1,2,3,4. Queste funzioni sono indissolubilmente legate alla loro complessa ultrastruttura.
L'ultrastruttura mitocondriale è stata descritta per la prima volta al microscopio elettronic....
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Protocollo
1. Tamponi e soluzioni madre
- Preparare una soluzione di acido 1 M di acido 3-morfolinopropano-1-solfonico (MOPS) in acqua deionizzata, pH 7,4. Conservare a 4 °C.
- Preparare 500 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in acqua deionizzata, pH 8,0. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare il sorbitolo 2,4 M in acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave.
- Preparare il saccarosio 2,5 M in acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave.
- Preparare 200 mM di fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) in isopropanolo. Con....
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Risultati
È relativamente facile separare le membrane mitocondriali interne ed esterne. Tuttavia, la generazione e la separazione delle vescicole contenenti il sito di contatto sono molto più difficili. A nostro avviso, due passaggi sono critici ed essenziali: le condizioni di sonicazione e il gradiente utilizzato.
Di solito, si pensa che i gradienti lineari abbiano una risoluzione migliore rispetto ai gradienti a gradini. Tuttavia, la loro produzione riproducibile è noiosa e richiede attrezzature speci.......
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Discussione
Il frazionamento mitocondriale è un esperimento complicato con diverse fasi molto complesse. Pertanto, abbiamo mirato a migliorare ulteriormente e, in una certa misura, semplificare il nostro metodoconsolidato 32. In questo caso, le sfide erano la necessità di attrezzature complicate e altamente specializzate, che spesso sono costruzioni individuali, e l'enorme consumo di tempo ed energia. A tal fine, abbiamo cercato di rimuovere le pompe e le singole costruzioni utilizzate per la colata e la racc.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.
Ringraziamenti
M.E.H. ringrazia la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), progetto numero 413985647, per il sostegno finanziario. Gli autori ringraziano il Dr. Michael Kiebler, dell'Università Ludwig-Maximilians di Monaco di Baviera, per il suo generoso e ampio sostegno. Siamo grati a Walter Neupert per il suo contributo scientifico, le discussioni utili e la continua ispirazione. J.F. ringrazia la Graduate School Life Science Munich (LSM) per il supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 13,2 mL, Provetta ultra-trasparente a parete sottile aperta, 14 x 89 mm | Beckman Instruments, Germania | 344059 | |
| 50 mL, Provetta aperta in policarbonato a parete spessa aperta, 29 x 104 mm | Beckman Instruments, Germania | 363647 | |
| Rotore ad angolo fisso A-25.50 - Alluminio, 8 x 50 mL, 25.000 giri/min, 75.600 x g | Beckman Instruments, Germania | 363055 | |
| Abbe rifrattometro | Zeiss, Germania | fuori produzione, qualsiasi rifrattometro Abbe può essere utilizzato | |
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | fuori produzione, qualsiasi pipetta controller sarà sufficiente |
| Becher 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Sonificatore digitale W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm MICROTIP conico | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200 e 400 Watt Sonificatori: Cella di raffreddamento a rosetta | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuga Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germania | B37912 | |
| Centrifuga Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germania | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Svizzera | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germania | 6213 | |
| EDTA (Acido etilendiammina-tetraacetico sale disodico diidrato) | Roth, Germania | 8043 | |
| Pallone di Erlenmeyer, 100 mL | Roth, Germania | X747.1 | |
| , Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germania | 1180170 | |
| pipetta graduata, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germania | 1180153 | |
| bagno di ghiaccio | neoLab, Germania | S12651 | |
| Agitatore magnetico RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germania | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (acido 3-(N-Morpholino)propansolfonico) | Gerbu, Germania | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | ||
| Omnifix 1 mL | Braun, Germania | 4022495251879 | |
| Fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF) | Serva, Germania | 32395.03 | |
| CANNULA STERICAN 21 Gx4 4/5 0,8x120 mm | Braun, Germania | 4022495052414 | |
| barra di agitazione, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Saccarosio | Merck, Germania | S8501 | |
| SW 41 Ti Rotore a secchiello oscillante | Beckman Instruments, Germania | 331362 | |
| Provette | Eppendorf, Germania | 3810X | |
| Macinatori di tessuti, tipo Potter-Elvehjem, recipiente di vetro da 2 mL | VWR, USA | 432-0200 | |
| Macinatori di tessuti, tipo Potter-Elvehjem, stantuffo da 2 mL con punta seghettata | VWR, USA | 432-0212 | |
| Acido tricloroacetico ( TCA) | Sigma Aldrich, Germania | 33731 | fuori produzione, qualsiasi TCA sarà sufficiente (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germania | 4855 |
Riferimenti
- Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863(2021).
- Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T.
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Ristampe e permessi
